Introduction

我想分享一篇2020年2月6日發(fā)在《Cell》的paper刨仑，“Co-incidence of Damage and Microbial Patterns Controls Localized Immune Responses in Roots”，一作是來自瑞士洛桑大學(xué)的周峰博士夹姥，碩博期間就特別優(yōu)秀杉武，師從萬建民院士，克隆了水稻中抑制獨(dú)腳金內(nèi)脂激素信號(hào)的基因DWARF53辙售，并對(duì)其功能進(jìn)行了研究轻抱，調(diào)控矮化和多分蘗，相關(guān)工作發(fā)在《Nature》上旦部，現(xiàn)已全職回國祈搜。我覺得本篇的亮點(diǎn)在于，一士八，創(chuàng)造性地采用一種新型的報(bào)告系統(tǒng)和細(xì)胞消融技術(shù)容燕。二，借單細(xì)胞測(cè)序的東風(fēng)婚度，在單細(xì)胞水平完成植物根系對(duì)天然免疫響應(yīng)的時(shí)空變化蘸秘。三，機(jī)制擴(kuò)充到多種PRR。四醋虏，根與根際有益(害)微生物寻咒。

文章回答了這樣一個(gè)問題：擬南芥根系在面臨損傷和病原菌侵染時(shí)，在單細(xì)胞水平如何激活下游的免疫響應(yīng)颈嚼。

Summary

對(duì)植物免疫響應(yīng)來說毛秘，識(shí)別病原菌聯(lián)系的分子模式(MAMPs)是至關(guān)重要的。這種復(fù)雜的感知系統(tǒng)不斷地暴露在微生物群組中粘舟，如何有效地應(yīng)用于根系仍然是個(gè)謎熔脂。通過觀察擬南芥根系在細(xì)胞水平上MAMP受體的表達(dá)模式和響應(yīng)水平，我們觀察到柑肴，已分化細(xì)胞的外層展示了低水平的PRR(pattern-recognition receptors)表達(dá)霞揉，并且缺乏下游的MAMP響應(yīng)。然而晰骑，這些細(xì)胞可以通過鄰近細(xì)胞的損傷而產(chǎn)生反應(yīng)适秩。小細(xì)胞簇的激光消融能強(qiáng)烈地上調(diào)其鄰近細(xì)胞的PRR表達(dá)，并且提高的PRR水平足夠引起非響應(yīng)細(xì)胞的免疫反應(yīng)硕舆。最后秽荞，局部損傷也會(huì)導(dǎo)致對(duì)非免疫原性有益菌的免疫反應(yīng)。損傷門控被受體過表達(dá)所覆蓋抚官，從而使病原菌無法在根際定植扬跋。我們的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞損傷可以“開啟”局部免疫反應(yīng)凌节，這有助于理解細(xì)胞損傷是如何發(fā)生的钦听，盡管土壤中存在微生物模式，但可以利用MAMP感知倍奢。

Background

背景就簡(jiǎn)單介紹一下朴上。如PTI的標(biāo)志過程，如ROS的累積卒煞，MAPK的激活痪宰，其他Marker基因的表達(dá)。

材料：triple mVENUS fused to a nuclear localization signal (NLS-3xmVENUS)畔裕，熒光marker材料衣撬，可以在體內(nèi)且在細(xì)胞水平分析MAMP的響應(yīng)，

MAMP響應(yīng)的marker基因：1.PER5 (PEROXIDASE 5)扮饶，受早期的MAMP誘導(dǎo)淮韭，且在根中高表達(dá)；2.WRKY11 (WRKY DNA-BINDING PROTEIN 11)贴届；3.MYB51(MYB DOMAIN PROTEIN 51)；4.FRK1 (FLG22-INDUCED RECEPTOR-LIKE KINASE 1)。

Results

flg22-Induced MAMP Responses Are Spatially Restricted in Arabidopsis Roots

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從圖1的ABC可得毫蚓，四種marker基因中占键，在經(jīng)過flg22處理根部后，PER5和FRK1背景噪音較低元潘、誘導(dǎo)性較好畔乙，且MAMP響應(yīng)的位置局限在分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)。對(duì)于已分化的根部分翩概，即使用高濃度的flg22處理牲距，也不能觀察到MAMP的響應(yīng)信號(hào)。（紅色是PI染色钥庇，綠色是熒光信號(hào)）

F1D-G.png

為了準(zhǔn)確評(píng)估特定細(xì)胞和細(xì)胞類型的信號(hào)牍鞠，作者產(chǎn)生了兩種marker的遺傳材料，另外一種是組成型表達(dá)且靶向質(zhì)膜的RFP评姨。作者在長(zhǎng)期觀察中發(fā)現(xiàn)难述，使用flag22處理后，在已分化的根中展示出減弱的吐句，空間限制的MAMP響應(yīng)淳附，而在側(cè)根形成過程中秘案，側(cè)根原基附近的細(xì)胞由于側(cè)根原基的頂出遭到了破壞，此時(shí)施加flg22，側(cè)根原基鄰近細(xì)胞展示出對(duì)MAMP處理較強(qiáng)的響應(yīng)（1D拍霜，1F，藍(lán)色箭頭表示側(cè)根原基形成點(diǎn)节视，虛線圈表示側(cè)根原基的形成拒炎，白色箭頭表示MAMP響應(yīng)）并且，當(dāng)有自發(fā)的择葡、非誘導(dǎo)性的細(xì)胞死亡時(shí)(1E*位置)紧武，在鄰近的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了flg22誘導(dǎo)的MAMP響應(yīng)，并且這種響應(yīng)是與受體(FLS2)有關(guān)的(1G)敏储。因此阻星，已分化的根有能力對(duì)MAMPs作出反應(yīng)，這種反應(yīng)被一種高度局部化的方式(側(cè)根原基形成已添，自發(fā)性細(xì)胞死亡)誘導(dǎo)妥箕。

Laser-Induced Cell Ablation Causes Localized MAMP Responsiveness in Roots

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(F2A白色星號(hào)代表激光消融的細(xì)胞，均在已分化的根操作,EP表皮,Co皮層,En內(nèi)皮層,St中柱細(xì)胞)

使用激光消融破壞了不同類型的根部細(xì)胞后更舞，我們只在鄰近細(xì)胞觀察到了強(qiáng)烈的flg22響應(yīng)增加畦幢。而對(duì)于被消融的細(xì)胞本身，導(dǎo)致了沒有或極少的MAMP marker基因的誘導(dǎo)缆蝉，揭示了本身的細(xì)胞破壞并不足以去引起強(qiáng)有力的MAMP的響應(yīng)宇葱。在表皮瘦真，皮層和內(nèi)皮層都被消融后，中柱細(xì)胞較強(qiáng)地響應(yīng)flag22的誘導(dǎo)黍瞧，然而表皮細(xì)胞的消融并不會(huì)造成其表皮鄰近細(xì)胞對(duì)flag22的響應(yīng)(F2AB)诸尽。

F2CD.png

早先我們知道，土壤中的有益微生物會(huì)定植在跟的伸長(zhǎng)區(qū)印颤，使用高劑量(1um)的flg22處理伸長(zhǎng)區(qū)(F1B)也就模擬了這種過程您机，不需要damage就能造成MAMP響應(yīng)。為了排除劑量效應(yīng)年局，我們想知道低劑量(100nm)的flg22配合細(xì)胞消融际看，會(huì)不會(huì)在鄰近細(xì)胞造成MAMP響應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)矢否，在施用100nm的flag22處理后仲闽，在無損傷的伸長(zhǎng)區(qū)只看到了少量的MAMP誘導(dǎo)響應(yīng)(F2CD)，但是如果破壞伸長(zhǎng)區(qū)的表皮細(xì)胞兴喂，其皮層細(xì)胞的MAMP響應(yīng)加強(qiáng)蔼囊，這一點(diǎn)與已分化的根相似(F2ABCD)。因此作者推測(cè)衣迷，損傷誘導(dǎo)的鄰近細(xì)胞MAMP響應(yīng)的增強(qiáng)可能發(fā)生在整個(gè)根部畏鼓。

Presence of DAMPs Alone Are Not Suffificient to Induce MAMP Responses

F3AB.png

到這里，作者想壶谒，會(huì)不會(huì)是cell damage產(chǎn)生的DAMPs引起了鄰近細(xì)胞的MAMP響應(yīng)云矫。于是作者選取了幾種經(jīng)典的DAMPs，如AtPEP1,ATP,Cellobiose,OGs,以及被cocktail處理過的上述四種DAMPs的混合物汗菜。每種DAMPs分別與flg22混合后處理發(fā)現(xiàn)让禀，即使使用高濃度的DAMPs也不能誘導(dǎo)強(qiáng)烈和持續(xù)的flag22響應(yīng)。[EZ出現(xiàn)熒光是因?yàn)楦邼舛?1um)flag22處理會(huì)引起MAMP響應(yīng)陨界，不需要cell damage].AtPEP1是個(gè)例外巡揍，只能引起DZ區(qū)微弱的FRK1響應(yīng)，而不是PER5響應(yīng)菌瘪。這就說明腮敌，鄰近細(xì)胞感知damage信號(hào)比作者想象的要復(fù)雜，并不是通過DAMPs俏扩，可能通過離子和滲透物的釋放或其他的機(jī)械壓力糜工。

MAMP Receptor Expression Is Induced by Cell Ablation and Is Suffificient to Induce Responsiveness

F4ABD.png

作者發(fā)現(xiàn)，在FLS2過表達(dá)材料中录淡，施用flg22處理能在已分化的外部根細(xì)胞層觀察到flg22的響應(yīng)(F4A)捌木，這也就暗示cell damage引起的鄰近細(xì)胞MAMP響應(yīng)是否和PRR表達(dá)量升高有關(guān)。

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我們發(fā)現(xiàn)嫉戚，不管在根的成熟區(qū)還是伸長(zhǎng)區(qū)刨裆，F(xiàn)LS2的轉(zhuǎn)錄水平在受到損傷的時(shí)候被激活(F4,BDFG)澈圈。并且FLS2在時(shí)間和空間的上調(diào)程度與觀察到的MAMP(FRK1和PER5)的響應(yīng)模式一致(F2ABCD與F4BCDF對(duì)比)。從F4E中崔拥，在受到cell damage和施加flag22后极舔，我們發(fā)現(xiàn)FLS2的局部表達(dá)水平升高。作者想知道是否FLS2的激活和MAMP響應(yīng)有關(guān)链瓦，發(fā)現(xiàn)在用相同flag22和cell damage處理的情況下，鄰近MAMP響應(yīng)的細(xì)胞和FLS2激活的細(xì)胞一致(F4HI)盯桦。這也就說明慈俯，cell damage誘導(dǎo)了PRR的高表達(dá)，并且足夠去引起MAMP響應(yīng)拥峦。

Casparian Strips Compartmentalize flg22 Responses in Differentiated Roots

(sgn3-3凱氏帶缺失突變體贴膘，外界物質(zhì)可直接進(jìn)入中柱鞘細(xì)胞。F5AB均為已分化的區(qū)域)

F5A-D.png

FLS2在中柱鞘細(xì)胞高表達(dá)略号，但在sgn3-3的成熟區(qū)刑峡，施加flg22沒有觀察到flg22的響應(yīng)，但是在過表達(dá)FLS2材料中玄柠，施加flg22突梦，在sgn3-3中觀察到了flg22響應(yīng)，野生型中卻沒有(F5AB,紅色箭頭處表示中柱鞘細(xì)胞羽利，由于凱氏帶的阻擋宫患，PI并不能對(duì)其染色)。這個(gè)結(jié)果說明凱氏帶能夠區(qū)室化免疫感知这弧。在WT中娃闲，F(xiàn)LS2的量并不能夠引起MAMP的響應(yīng)，但是強(qiáng)啟動(dòng)子卻可以(F5.AB 3rd column)匾浪。

Suberin Lamellae Interfere with flg22 Perception in the Endodermis

sgn3:凱氏帶在延伸起始后25細(xì)胞期不連續(xù)

esb1:凱氏帶在延伸起始后25細(xì)胞期不連續(xù)皇帮，內(nèi)胚層提前栓質(zhì)化。

ABA-treated:內(nèi)胚層提前栓質(zhì)化蛋辈。

凱氏帶功能是阻止外部物質(zhì)進(jìn)入中柱細(xì)胞属拾，而內(nèi)栓層(一種次級(jí)細(xì)胞壁修飾)，最終圍繞在整個(gè)內(nèi)胚層并且抑制了內(nèi)胚層的分子吸收梯浪，因?yàn)槭杷缘膬?nèi)栓層不允許來自細(xì)胞壁的分子進(jìn)入內(nèi)皮層的細(xì)胞膜(F5,CD)捌年。

我們發(fā)現(xiàn)早期分化的內(nèi)皮層(開始延伸后的25細(xì)胞期，沒有栓化)在FLS2過表達(dá)材料中表現(xiàn)出對(duì)flg22的響應(yīng)挂洛，但在后期內(nèi)皮層細(xì)胞(開始延伸后的55細(xì)胞期礼预，栓化)沒有表現(xiàn)出對(duì)flg22的響應(yīng)。(F.5E,2nd column)在esb1和ABA-treated中虏劲，flg22的響應(yīng)在早期的內(nèi)胚層被抑制托酸，展示出細(xì)胞保護(hù)性的提前栓質(zhì)化使得FLS2無法與flg22結(jié)合(F.5E)褒颈。即使是在根部成熟區(qū)，破壞表皮和皮層励堡，這種現(xiàn)象(內(nèi)胚層提前栓化導(dǎo)致的FLS2與flg22隔絕)(F.5F)也同樣發(fā)生谷丸。

Cell Damage Activates Expression of Multiple Pattern Recognition Receptors

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做完一個(gè)受體的機(jī)制后，作者就想把機(jī)制擴(kuò)大应结，接下來找到了三種PRR刨疼，EFR,CERK1,RLP23.作者觀察到，在cell damage情況下鹅龄，這三種受體的都出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)揩慕，這就揭示了cell damage介導(dǎo)了一種十分普遍的應(yīng)對(duì)MAMPs時(shí)的上調(diào)響應(yīng)。(F6AB)

F6C-F.png

做完經(jīng)典的LRR domain的受體扮休，作者又想在非經(jīng)典的受體上是否還適用呢迎卤，如LORE(LIPOOLIGOSACCHARIDE-SPECIFIC REDUCED ELICITATION)。相似的是玷坠，在早期分化的細(xì)胞被破壞后蜗搔，LORE的表達(dá)也被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，并且施加其配體也主導(dǎo)了在伸長(zhǎng)區(qū)MAMP的響應(yīng)八堡，而不是在成熟區(qū)樟凄，這一點(diǎn)與flg22相似(F6D)。這就把這條機(jī)制延伸到了其他PRR.

Local Gating of Immune Responses by Damage in Root-Bacteria Interactions

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剛剛都是細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)秕重，最終還是要落實(shí)到實(shí)際情況上不同。使用有益菌(CHA0)進(jìn)行根部侵染，作者觀察到溶耘，盡管在根部有較強(qiáng)的定植二拐，但在沒有受到破壞的已分化根部沒有觀察到MAMP響應(yīng)，與細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)類似的是凳兵，在側(cè)根原基形成的鄰近細(xì)胞(自發(fā)破壞)觀察到了MAMP響應(yīng)百新，過表達(dá)FLS2并不需要cell damage就能引起MAMP響應(yīng)(F7A)。當(dāng)細(xì)菌侵染與細(xì)胞消融結(jié)合起來時(shí)庐扫，鄰近破壞位點(diǎn)的細(xì)胞在有細(xì)菌存在時(shí)展示出對(duì)MAMP的響應(yīng)(F7BC)饭望。【細(xì)菌提供了各種ligand】

F7C-F.png

作者接下來使用對(duì)根際有害的菌,GMI1000形庭，GMI1000最初的侵染并不會(huì)造成細(xì)胞破壞和強(qiáng)烈的MAMP響應(yīng)铅辞，但是繼續(xù)侵染會(huì)造成一些表皮細(xì)胞死亡，這個(gè)時(shí)候就能在鄰近細(xì)胞觀察到局部的MAMP響應(yīng)升高(F7D)萨醒。在FLS2過表達(dá)材料的成熟區(qū)中斟珊，不管用flg22處理(F4A)還是有益菌侵染(F7A)都展示出MAMP響應(yīng)和低的菌生長(zhǎng)量(F7A,E)。這里有意思的是富纸，有害菌GMI1000的flagellin并不能激活擬南芥的FLS2受體囤踩。

作者提出的模式圖見F7F旨椒，就不贅述了。

Inspiration for me

1.把試驗(yàn)做細(xì)堵漱，大框架已經(jīng)建好综慎，細(xì)節(jié)見成敗。

2.多做近似相等勤庐，比如示惊，A=B,B=C,那么A=C。

3.每一步試驗(yàn)都需要做埃元，不能偷懶且想當(dāng)然涝涤，畢竟生物體這么復(fù)雜~