CRISPR/Cas9技術(shù)是當(dāng)下科研圈最炙手可熱的技術(shù)梦谜。而我本身并不是從事基因編輯研究，當(dāng)實(shí)驗(yàn)往前推進(jìn)時(shí)，需要借助已經(jīng)搭建好的CRISPR/Cas9平臺(tái)來(lái)運(yùn)用時(shí)候思恐，發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題，這些問(wèn)題是我整個(gè)過(guò)程中一步步摸索得出膊毁，也是不斷的質(zhì)疑并給出合理解釋和解決辦法的過(guò)程胀莹。
1. 基因編輯體系優(yōu)化：
先前實(shí)驗(yàn)室建立的基因編輯，可以實(shí)現(xiàn)基因的定向突變婚温，因此沿著之前的步驟進(jìn)行描焰，卻沒(méi)有檢測(cè)到突變。所有的后續(xù)分析都是建立在之前的體系基礎(chǔ)上，不曾懷疑總體的思路體系是否優(yōu)化荆秦。要知道篱竭，前人建立體系只是驗(yàn)證了該體系切實(shí)可行，并未對(duì)體系是否最優(yōu)化做探索步绸，因此循規(guī)蹈矩的重復(fù)掺逼，并不能解決自己遇到的問(wèn)題。sgRNA注射濃度瓤介、篩選突變的方法等等吕喘，都是一個(gè)值得優(yōu)化的地方。
胚胎干燥程度刑桑，是胚胎處理的至關(guān)重要的環(huán)節(jié)氯质，干燥不充分不能接納注射液體，干燥過(guò)度則胚胎死亡祠斧。所以設(shè)計(jì)了新的控制干燥程度的設(shè)備闻察，來(lái)對(duì)干燥程度進(jìn)行更為精準(zhǔn)的控制，不在受制于環(huán)境溫濕度的影響琢锋。
一味的追求胚胎注射存活率蜓陌，是對(duì)基因編輯錯(cuò)誤的導(dǎo)向。存活率并沒(méi)有實(shí)質(zhì)性意義吩蔑，而突變率才是黃金標(biāo)準(zhǔn)钮热。通過(guò)提高注射蛋白或sgRNA濃度，加大注射劑量等來(lái)提高突變烛芬，才是切實(shí)可行的辦法隧期。
2. sgRNA活性
對(duì)sgRNA進(jìn)行篩選的步驟是體外活性檢測(cè)，通過(guò)體外與Cas9蛋白形成RNP復(fù)合體赘娄，然后切割DNA片段仆潮，依次來(lái)評(píng)估sgRNA是否有活性。但是體外實(shí)驗(yàn)畢竟是體外遣臼，并不能模擬體內(nèi)真是的效果性置。根據(jù)我的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，體外證實(shí)高活性的sgRNA有可能在體內(nèi)表現(xiàn)并不盡人意揍堰。但是該方法至少提供了一種評(píng)估的辦法鹏浅，所以對(duì)待sgRNA活性，也不能一味的依體外效果而盲從屏歹，需要活體的進(jìn)一步驗(yàn)證隐砸。
3. 突變體T7E1酶切和測(cè)序檢測(cè)
DNA序列多態(tài)性。SNP在人類基因組中廣泛存在蝙眶，平均每300個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)季希，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異式塌，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)博敬，也有可能在基因以外的非編碼序列上》宄ⅲ總的來(lái)說(shuō)偏窝，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(coding SNP,cSNP)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)境析，其變異率僅及周圍序列的1/5囚枪。
正是因?yàn)镾NP位點(diǎn)是存在派诬，所以野生型DNA的PCR產(chǎn)物劳淆，做T7E1酶切，同樣可以將DNA剪切成長(zhǎng)短不一的DNA片段默赂。尤其是非編碼DNA序列的突變沛鸵，采用T7E1酶切并不可行。
同時(shí)缆八，在非編碼DNA區(qū)域曲掰，更是存在著大量的AATT序列，所以采取突變樣本的一代測(cè)序檢測(cè)奈辰，通過(guò)套峰來(lái)判斷是否突變栏妖，也并不可行。
通過(guò)設(shè)計(jì)引物奖恰，對(duì)SNP或AATT區(qū)域進(jìn)行規(guī)避吊趾，可以解決部分問(wèn)題，但是并不適用于一切突變位點(diǎn)瑟啃。DNA序列上存在大量的酶切位點(diǎn)论泛，NEB等酶制劑公司篩選出了大量的限制性內(nèi)切酶，是很好的分子工具蛹屿。突變會(huì)更改原先的DNA序列屁奏，改變了內(nèi)切酶的堿基識(shí)別序列，所以采用獨(dú)特的內(nèi)切酶错负，能夠輕松的識(shí)別突變坟瓢。sgRNA并未嚴(yán)格切割預(yù)期的地點(diǎn)，所以突變樣本PCR后用sgRNA再次切割驗(yàn)證是否改變sgRNA識(shí)別的序列犹撒，也是不錯(cuò)的選擇载绿。
4. 敲入突變
當(dāng)數(shù)次的突變失敗后，也曾懷疑是否機(jī)體內(nèi)非同源末端修復(fù)油航，導(dǎo)致突變的區(qū)域又重新修復(fù)崭庸，所以嘗試著提供donor DNA辦法。傳統(tǒng)提供double strand DNA雖然制備簡(jiǎn)單，但是效果并不高怕享，更為高效和受推崇的是single strand DNA执赡。可以通過(guò)生物公司合成函筋，150nt長(zhǎng)度約合人民幣3000沙合；也可以采用試劑盒合成，類似的試劑盒價(jià)格昂貴且可選擇的產(chǎn)品寥寥無(wú)幾跌帐，無(wú)奈只能自己制備首懈。所以結(jié)合自身的生物學(xué)理解提出的RNA-cDNA-ssDNA辦法，又契合了已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)谨敛。雖說(shuō)又protocol究履，但是具體何成途徑以及檢測(cè)ssODN的辦法，又沒(méi)有給出細(xì)致的說(shuō)明脸狸。
前后反復(fù)試驗(yàn)并對(duì)何成產(chǎn)品的質(zhì)量做了探索性的實(shí)驗(yàn)最仑，最后成功制備出真正意義上的ssODN。且篩選出了改進(jìn)后可以用于純化ssODN的試劑盒炊甲，并且達(dá)到一定注射濃度劑量需求泥彤。
5. 突變檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程
傳統(tǒng)突變檢測(cè)，存活的個(gè)體在產(chǎn)生足夠數(shù)量的后代后卿啡，再采提取G0代DNA吟吝，然后PCR擴(kuò)增，酶切檢測(cè)或者測(cè)序檢測(cè)颈娜。但是從胚胎至產(chǎn)生后代周期約1個(gè)月剑逃，而且對(duì)全部個(gè)體提DNA，PCR擴(kuò)增揭鳞，酶切檢測(cè)炕贵，真的是time-consuming and laborious。所以亟待通過(guò)標(biāo)記辦法來(lái)解決實(shí)驗(yàn)勞動(dòng)強(qiáng)度大的問(wèn)題野崇。
構(gòu)建標(biāo)記基因称开。熒光標(biāo)記需要大片段插入，雖然截短的EGFP可以使得插入序列更短乓梨，但是需要首先構(gòu)建好分泌型長(zhǎng)片段鳖轰，加之短片段可以翻譯并表達(dá)，又是一個(gè)更為不錯(cuò)的idea扶镀。但是距離實(shí)際應(yīng)用相距甚遠(yuǎn)蕴侣。Co-CRISPR/Cas9是眼下最為可行的辦法，即通過(guò)肉眼可見(jiàn)的標(biāo)記（眼色）和Gene of Interest共注射的辦法解決臭觉。第一步即對(duì)white sgRNA有效性進(jìn)行篩選昆雀，找到了比已發(fā)表文獻(xiàn)更為高效率的sgRNA辱志，即在G0代就能達(dá)到完全白化的效果。通過(guò)white眼色基因和GOI共注射狞膘，然后在眼色突變的存活后代中檢測(cè)GOI突變揩懒，可以極大縮小范圍，減輕實(shí)驗(yàn)勞動(dòng)強(qiáng)度挽封。
綜上已球，沒(méi)有信手拈來(lái)的借用，做科研上更是忌諱一味的'拿來(lái)主義'辅愿，不能全盤(pán)照抄而不假思索智亮，看似簡(jiǎn)單平常的步驟都凝聚了實(shí)驗(yàn)人員的大量實(shí)驗(yàn)付出，有更多值得深究的技術(shù)問(wèn)題点待，這也告誡自己阔蛉，學(xué)會(huì)獨(dú)立思考和分析。任何時(shí)候都要保持思想的獨(dú)立亦鳞，在旁征博引的同時(shí)要擺脫前人的思維框架和體系馍忽，汲取有益成果并能推陳出新棒坏，做出自己的真正意義上的科學(xué)結(jié)論燕差。
