蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用具有十分重要的生物學(xué)意義，例如：轉(zhuǎn)錄因子與基因組DNA的相互作用對于基因的表達(dá)具有調(diào)控作用姊氓；基因組不同位置的不同類型的組蛋白往往會與基因的表達(dá)活性相關(guān)聯(lián)等。

而在蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用研究當(dāng)中喷好，ChIP-seq當(dāng)屬經(jīng)典技術(shù)翔横，可以說為后來一系列技術(shù)的發(fā)展開拓了很好的思路，但是傳統(tǒng)的ChIP-seq也存在一些問題：

• 信號比較雜梗搅，背景噪聲很大禾唁，所以常常需要input的數(shù)據(jù)來進(jìn)行背景的處理；
• 細(xì)胞數(shù)量要求較高无切，在實現(xiàn)利用少量細(xì)胞進(jìn)行實驗的方面有一定的困難蟀俊；
• 實驗耗時長，一般需要3天才能完成整套實驗流程订雾；
• 數(shù)據(jù)的重復(fù)性較差肢预，且需要利用超聲打斷基因組DNA，打斷的條件需要經(jīng)過摸索洼哎，需有一定的經(jīng)驗基礎(chǔ)烫映。

CUT&Tag技術(shù)優(yōu)勢

在2019年，美國弗雷德哈欽森癌癥研究中心的 Henikoff 博士在 Nature Communications上首次發(fā)布 CUT&Tag 技術(shù)^[1]噩峦，相比較于ChIP-seq技術(shù)锭沟，CUT&Tag 在這些方面具有獨特優(yōu)勢：

• 對于起始實驗細(xì)胞數(shù)量沒有較高要求，據(jù)說可以最低60個細(xì)胞（還是要看你做的轉(zhuǎn)錄因子是什么吧）识补；
• 一般來說不需要進(jìn)行甲醛交聯(lián)（注意是一般）族淮；
• 不需要進(jìn)行超聲打斷（所以一般不需要甲醛交聯(lián)）；
• 不需要進(jìn)行免疫共沉淀的實驗過程。

當(dāng)然祝辣，整項技術(shù)還是基于抗原抗體結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行構(gòu)建的贴妻，上面的優(yōu)勢決定了 CUT&Tag 具有以下特點：

CUT&Tag

• 相較之于ChIP-seq具有更低的背景噪聲（以至于一般進(jìn)行數(shù)據(jù)分析可以不用input的數(shù)據(jù)來去除背景）；（track2 vs track4）
• 高精度（細(xì)胞數(shù)）蝙斜；（track1 vs track2 vs track4)

Reproducibility and efficiency of CUT&Tag

• 具有更高的數(shù)據(jù)可重復(fù)性名惩；

Efficiency of CUT&Tag

• 具有更高的捕獲效率。

關(guān)于甲醛交聯(lián)

在ChIP-seq中常常使用到的甲醛交聯(lián)主要是讓蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)一DNA,蛋白質(zhì)一RNA之間交聯(lián)孕荠，最主要的目的還是讓我們想研究的蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用更加緊密娩鹉，防止在后續(xù)的實驗中導(dǎo)致脫落。但是這也會帶來一些問題：

• 甲醛交聯(lián)的活性僅限于胺稚伍，而且交聯(lián)效率也很低弯予，所以需要的細(xì)胞數(shù)量就很大；
• 可能導(dǎo)致蛋白與蛋白个曙、蛋白與核酸之間的非特異性結(jié)合熙涤，使實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性；
• 蛋白與蛋白之間的交聯(lián)還有可能遮蓋抗原表位困檩，使得抗體作用性能降低祠挫。

2014年發(fā)表在 Brief Funct Genomics 上的文章 In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis 就專門就甲醛交聯(lián)在研究蛋白與DNA之間的相互作用提出了可能存在的問題，甲醛交聯(lián)并不能交聯(lián)所有蛋白與DNA之間的相互作用悼沿，例如 lac阻遏蛋白和 NF-kB 就不會被交聯(lián)^[2]等舔。總之就是大家不要把甲醛交聯(lián)想的那么神糟趾，那么萬能慌植。

注意我前面提到的 CUT&Tag 一般不需要甲醛交聯(lián)，為什么是一般义郑？如果你所要研究的轉(zhuǎn)錄因子與基因組的結(jié)合較弱或者量很少蝶柿，這個時候為了得到的更好的實驗結(jié)果，你就可能需要使用甲醛進(jìn)行輕交聯(lián)非驮，同樣是美國弗雷德哈欽森癌癥研究中心的 Henikoff 博士課題組交汤，他們在2020年將 CUT&Tag 實驗流程發(fā)表在 Nature Protocols 上，其中就提到了使用甲醛進(jìn)行輕交聯(lián)的可選步驟（0.1%的甲醛室溫下交聯(lián)2分鐘）^[3]劫笙，ChIP-seq 的甲醛交聯(lián)可是使用1%的甲醛交聯(lián)10-15分鐘芙扎！

CUT&Tag流程概述

CUT&tag

• 細(xì)胞收集

不同于傳統(tǒng)的每次離心收集細(xì)胞，CUT&Tag 使用連有刀豆蛋白A的磁珠（concanavalin A beads）進(jìn)行細(xì)胞的收集填大，刀豆蛋白能夠與細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合（原理是與膜上的糖蛋白結(jié)合）戒洼。然后利用磁珠每次收集細(xì)胞。結(jié)合后還需要使用非離子去垢劑洋地黃皂苷（digitonin）對細(xì)胞膜進(jìn)行通透（原理是與膽固醇分子結(jié)合）允华，為抗體等的進(jìn)入提供可能性圈浇。

• 一抗寥掐、二抗結(jié)合

這里的一抗就是針對你的研究靶蛋白所設(shè)計的特異性抗體，必要時需要輔助IP實驗檢驗抗體的特異性磷蜀。

• Tn5轉(zhuǎn)座酶結(jié)合

這里一般使用Protein A/G-Tn5體系來實現(xiàn)Tn5轉(zhuǎn)座酶的結(jié)合召耘，proteinA/G對于IgG的Fc段具有很高的親和性，常常被應(yīng)用于IgG抗體的純化蠕搜，所以使用proteinA/G就能把Tn5轉(zhuǎn)座酶帶到IgG二抗結(jié)合的基因組位點怎茫。

• 片段化

通過添加含有鎂離子的反應(yīng)液使Tn5轉(zhuǎn)座酶開始發(fā)揮作用收壕，這里面的細(xì)節(jié)可以參考我前面的帖子組學(xué)技術(shù)——ATAC-seq妓灌。

• DNA提取與文庫構(gòu)建

關(guān)于對照組的設(shè)置

如果你確實有設(shè)置對照組的需求，CUT&Tag一般會有兩種對照：陽性對照一般選擇與基因組DNA相互作用較高的蛋白蜜宪，例如組蛋白虫埂；陰性對照可以使用不加入一抗而正常加入二抗和Tn5轉(zhuǎn)座酶的體系，查看是否存在Tn5轉(zhuǎn)座酶亂切的情況圃验，或者也可加入非特異性的IgG作為陰性對照掉伏。

References
[1] Kaya-Okur, Hatice S et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature communications vol. 10,1 1930. 29 Apr. 2019, doi:10.1038/s41467-019-09982-5.
[2] Gavrilov, Alexey et al. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in functional genomics vol. 14,2 (2015): 163-5. doi:10.1093/bfgp/elu037.
[3] Kaya-Okur, Hatice S et al. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature protocols vol. 15,10 (2020): 3264-3283. doi:10.1038/s41596-020-0373-x.