系列筆記基于達(dá)澈生物講座視頻粮宛，從中初步學(xué)習(xí)了解生信分析中常遇到的組學(xué)分析技術(shù)滞时。
ChIP-seq和 CUT&Tag叁幢、CUT&RUN講座視頻筆記 - 簡書
ATAC-seq講座視頻筆記 - 簡書
CLIP、RIP-seq講座視頻筆記 - 簡書
Ribo-seq講座視頻筆記 - 簡書
RIC-seq講座視頻學(xué)習(xí) - 簡書
(eccDNA)circle-seq講座視頻學(xué)習(xí) - 簡書
0坪稽、總綱
- ChIP-seq是探究有特定蛋白結(jié)合的DNA片段曼玩，即蛋白與DNA特定區(qū)域的互作關(guān)系；
-
CUT&RUN窒百、CUT&TAG是近些年提出的兩個更高效的實驗設(shè)計黍判。
image from ENCODE
1、ChIP-seq（Chromatin Immuno-Precipitation）
染色體免疫共沉淀反應(yīng)
1.1 上游實驗原理
A 實驗步驟
參考下圖篙梢，主要分為5步
（1）甲醛交聯(lián)
- 將目標(biāo)蛋白（根據(jù)實驗?zāi)康亩ǎ┚o密綁定到其可以與DNA連接的位置上顷帖；
- 目標(biāo)蛋白是我們感興趣的蛋白，例如有特定修飾的組蛋白渤滞；
- 我想就是為避免下一步超聲時脫離贬墩；
（2）超聲打斷
- 將所有DNA打斷成一定長度的小片段；
-
所有片段可分為兩大類：有特定蛋白結(jié)合的妄呕，無特定蛋白結(jié)合的
5 steps of ChIP-seq
（3）片段富集
- 根據(jù)目標(biāo)蛋白陶舞，添加特異抗體，形成抗體與目標(biāo)蛋白免疫沉淀復(fù)合物趴腋；
- 然后用磁珠分離富集
（4）文庫構(gòu)建
- 去交聯(lián)吊说，純化DNA；
- 加接頭优炬，擴(kuò)增
（5）測序
- illumina二代測序
B 技術(shù)難點
（1）實驗步驟較多颁井，參數(shù)設(shè)置優(yōu)化
- 例如交聯(lián)、超聲等參數(shù)設(shè)置需要實驗摸索蠢护；
- 整個實驗周期大概三天左右雅宾。
（2）抗體選擇
- 對于任何一種特定的靶抗原，都有不止一種有效抗體葵硕；
-
如何篩選高質(zhì)量的抗體是很重要的（因為不做實驗眉抬，就不細(xì)述了）
磁珠對蛋白免疫沉淀復(fù)合物的富集.png
（3）結(jié)果解讀
chip-seq的結(jié)果有時存在背景高贯吓、非特異性的peak的缺點；即目標(biāo)DNA片段分布不是很集中蜀变。原因可能如下
- 甲醛過度交聯(lián)導(dǎo)致蛋白與非目標(biāo)DNA位置結(jié)合悄谐；
- 非特異性DNA與Bead直接結(jié)合（solution：可用Salmon Sperm DNA封閉）；
- 抗體特異性不強(qiáng)库北；
- ........
C 對照設(shè)計
（1）input對照（必做）
即相同實驗條件下爬舰，進(jìn)行到第二步超聲打斷的結(jié)果。目的主要是
-
可以驗證DNA斷裂的效果（片段長度分布）
sonication超聲 - 可根據(jù)input中靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列含量寒瓦，按照取樣比例換算出CHIP的效率情屹；
（2）陽性對照（選做）
主要目的是驗證chip-seq實驗理論上有目標(biāo)蛋白結(jié)合就會出現(xiàn)peak的
- 一般使用anti-RNA PolymeraseⅡ抗體；
- 因為該抗體是通用轉(zhuǎn)錄因子杂腰，在所有細(xì)胞中都能結(jié)合基因的核心啟動子區(qū)垃你。因此理論上chip后都會有條帶。
（3）陰性對照（選做）
主要目的是驗證chip-seq實驗理論上沒有目標(biāo)蛋白結(jié)合就會不出現(xiàn)peak的
- 一般用普通的IgG抗體
陽性喂很、陰性對照的例圖可見筆記最后
1.2 下游數(shù)據(jù)分析
參考下圖惜颇，chip-seq的數(shù)據(jù)分析常規(guī)流程如下
（1）RAW data→Clean data
- 質(zhì)控（QC）；
- 去接頭(cutadapt)
（2）Alignment
- bwa少辣、bowties等biosoft官还，重點關(guān)注mapping rate
- visualization(deepTools/IGV)
（3）Peakcalling
- ChIP-seq的必做步驟，研究蛋白bindinng的DNA片段相對集中區(qū)域
- MACS2軟件毒坛，之前的關(guān)于MACS筆記見鏈接
-
根據(jù)peak分布結(jié)果可進(jìn)一步嘗試motif analysis(Homer)，gene annotation(Homer)→GO/KEGG(R)林说，并且聯(lián)和RNA-seq DEG煎殷、ATAC-seq等
image from 達(dá)澈生物
2、CUT&RUN腿箩、CUT&TAG
- ChIP-seq主要用超聲打斷的方式切割DNA片段豪直，
- 近些年出現(xiàn)的CUT&RUN、CUT&TAG則主要利用酶切的方式
2.1 cut&run
cleavage under targets and release using nuclease
大致步驟如下
- （1）抗體結(jié)合綁在DNA上的靶向蛋白珠移；
- （2）Protein A-MNase酶復(fù)合物與抗體交聯(lián)弓乙；
MNase酶為DNA內(nèi)切酶，可切斷所識別到的DNA片段
- （3）鈣離子激活MNase酶钧惧，剪下目標(biāo)蛋白所連的目標(biāo)DNA片段暇韧；
- （4）蛋白復(fù)合物富集
2.2 cut&tag
cleavage under targets and tagmentation
大致步驟如下
- (1) 一抗結(jié)合目標(biāo)蛋白，二抗結(jié)合一抗(信號放大)浓瞪；
- (2) 加入protein A-Tn5酶復(fù)合物
Tn5酶是轉(zhuǎn)座酶懈玻，ATAC實驗常用，完成剪切乾颁、粘貼的作用涂乌；
- 剪下目標(biāo)蛋白所連接的目標(biāo)DNA片段艺栈，并在兩邊加上接頭（建庫更方便）
2.3 相比于ChIP-seq的優(yōu)勢
- 實驗材料(細(xì)胞)使用量少，適合珍貴樣品湾盒；
- 不需要超聲打斷湿右，因此也可不做甲醛固定（前提是新鮮細(xì)胞）；
- 實驗周期短罚勾，兩天左右毅人；
- 數(shù)據(jù)背景信號非常低！可參考一篇paper的比較
