前言
個(gè)人覺得還是很有必要搞清楚測(cè)序原理和樣本制備以及樣本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等等一些列環(huán)節(jié)的關(guān)節(jié)問題奔穿，如此才能全方位把控整個(gè)項(xiàng)目的質(zhì)量。
RNA-Seq的原理
我在一年前看過超過9個(gè)視頻簡(jiǎn)介，但是還是沒學(xué)得咋樣，這兩天在家又看了一遍陳巍學(xué)基因，大致明白了illumia的測(cè)序原理，可見學(xué)習(xí)有時(shí)候需要循序漸進(jìn)摊唇，即使一開始花了很大的苦功，也不見得就可以理解涯鲁。
1. 首先在芯片上有共價(jià)鍵連接的DNA引物巷查；
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通道內(nèi)表面有共價(jià)鍵連接的2種引物
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flowcell的內(nèi)部結(jié)構(gòu)
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2. DNA文庫：DNA片段加上兩端的DNA接頭；
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3. DNA文庫加入到芯片中后抹腿，通過引物互補(bǔ)雜交就可以固定住文庫岛请，加dNTPs和酶之后，就可以通過擴(kuò)增出文庫互補(bǔ)鏈警绩；
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4. 加入堿液解鏈崇败，沖走文庫，留下互補(bǔ)鏈（因?yàn)榛パa(bǔ)鏈的引物是共價(jià)連接在芯片上的）肩祥；
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5. 加入中和液后后室，留下來的互補(bǔ)液會(huì)彎腰下來，和芯片上的另外一種引物互補(bǔ)結(jié)合混狠；加入dNTPs和酶岸霹，就可以合成新的互補(bǔ)鏈。
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合成新的互補(bǔ)鏈
6. 加堿液檀蹋，解鏈松申，只留下和芯片共價(jià)結(jié)合的鏈；再加中和液俯逾，再反應(yīng)贸桶，如此循環(huán)，完成擴(kuò)增桌肴。
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7. 之后就是邊合成邊測(cè)序了皇筛，那么現(xiàn)在需要測(cè)序引物和聚合酶以及帶熒光標(biāo)簽的dNTPs合成，每合成一個(gè)讀一次坠七，不斷循環(huán)水醋。
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8. 讀取index：先把read1沖走，加入read2的引物彪置。
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9. 雙端測(cè)序：先倒鏈合成出互補(bǔ)鏈拄踪，然后解鏈，沖走拳魁，按照第一端的原理再讀一遍惶桐。
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10. 數(shù)據(jù)量非常大
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感興趣的話，最好把HiSeq測(cè)序儀的原理學(xué)一下潘懊，這里我就不放了姚糊。
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