Author：J.F.XIE
Date：23-03-2021
384孔熒光定量的普及懊渡，使得批量檢測基因變得更加便捷笋除、高效袜爪，極大地提升了實驗效率。傳統(tǒng)手動加樣需保持精神高度集中娜搂，初學(xué)者往往因為移液操作不熟練導(dǎo)致加樣不均迁霎，加樣錯孔更導(dǎo)致實驗失敗，種種弊端制約了熒光檢測的效率百宇。在當前實驗室條件下考廉，通過采用專用的設(shè)備耗材，進行合理的排版和運算携御，即可實現(xiàn)批量操作昌粤，下文給出具體方案。
專用設(shè)備耗材三件套：
A：ABI 384 PCR板：
B：八聯(lián)排移液器：
C：巴洛克加樣槽
1. 384PCR反應(yīng)體系：
| cDNA | 2ul |
|---|---|
| F/R Primer | 0.4ul |
| SYBR Mix | 5ul |
| H2O | 2.2ul |
2. 添加預(yù)混液（引物因痛、Mix和H2O）
常規(guī)的排槍為8Tips婚苹，其間距與96孔板、10ul槍頭座間距相一致鸵膏；
而384孔間距為正常PCR板的1/2膊升。
因此，加樣時候谭企，必須間隔一孔加樣廓译。
由于移液損失等原因评肆，手動加樣建議"滿10添1"，而排槍加樣建議"滿6添1"（筆者經(jīng)驗）非区。
例如瓜挽，熒光檢測RNAi干擾Vg基因，EGFP做對照征绸，每個處理6個生物重復(fù)久橙，3個技術(shù)復(fù)孔。
首先按照反應(yīng)體系配置預(yù)混液管怠，均勻分裝到12孔加樣槽內(nèi)（此處只用到了6槽）淆衷，每槽加樣56ul，然后使用排槍將預(yù)混液依次加入到對應(yīng)的384孔內(nèi)渤弛。當總預(yù)混液體積少時更推薦用酶標板或八聯(lián)排PCR管祝拯。
然后同樣操作加入cDNA樣。
3. 排版示意圖及操作：
Step1.
添加內(nèi)參預(yù)混液她肯，黃色色塊佳头；
Step2.
添加內(nèi)參預(yù)混液，紅色色塊晴氨；
Step3.
添加檢測基因Vg預(yù)混液康嘉，深藍色色塊；
Step4.
添加檢測基因Vg預(yù)混液瑞筐，紫色色塊凄鼻；
Step5.
cDNA稀釋液按照對應(yīng)次序排列，切記間隔加樣聚假。依次按照預(yù)混液加樣順序块蚌，添加模板cDNA即可。
評價：
傳統(tǒng)加樣耗時費力膘格，對操作技巧峭范、體力等有較高要求。如果環(huán)境溫度過高瘪贱，加樣周期長纱控，部分液體揮發(fā)，導(dǎo)致復(fù)孔之間差異較大菜秦，為后續(xù)分析帶來不便甜害。視野在模板和加樣孔之間來回切換，容易視覺疲勞球昨，導(dǎo)致加樣錯誤尔店。
較傳統(tǒng)手動單孔加樣，排槍加樣只需要提前計算好加樣體積，并將預(yù)混好的反應(yīng)液提前分裝到加樣槽內(nèi)嚣州，然后間隔加樣鲫售。計算好體系，依次按照排版加樣该肴，效率顯著提升情竹，并且避免手動加樣錯位，復(fù)孔之間重復(fù)性更穩(wěn)定匀哄，結(jié)果更穩(wěn)健秦效。
