本期解讀

iTRAQ-based quantitative proteomic reveals proteomic changes in Serratia sp. CM01 and mechanism of Cr(Ⅵ) resistance

發(fā)表雜志：Ecotoxicology and Environmental Safety

發(fā)表日期：2021.11.22

影響因子：6.291

技術(shù)：iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

研究背景

Cr (Ⅵ)是世界范圍內(nèi)常用的重金屬兴喂，處理Cr(Ⅵ)污染最有效的方法是將Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化為Cr(III)昧廷。許多微生物具有還原Cr(Ⅵ)的能力免都，然而，降Cr(Ⅵ)微生物的開發(fā)仍停留在篩選、分離、鑒定等表面階段，這些細(xì)菌在Cr(Ⅵ)脅迫下的反應(yīng)機(jī)制尚不清楚。Serratia?sp. CM01是一株具有抗Cr和還原能力的野生菌株涮雷，這篇文章通過iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和一系列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)闡明了CM01耐Cr(Ⅵ)或降低Cr的可能存在的機(jī)制。

技術(shù)路線

01 野生型菌株和馴化菌株分別在無Cr和含Cr中培養(yǎng)

02 iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)探討分子機(jī)制

03 差異蛋白系統(tǒng)分析

04 RT-PCR（基因水平驗(yàn)證）

05 疏水性和自聚焦性轻局、葡萄糖含量和總SOD活性（表觀驗(yàn)證）

06 分子機(jī)制討論

研究結(jié)果

1份殿、差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定、功能注釋和富集分析

首先作者通過iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)嗽交，在WT CM01和馴化的CM01總共鑒定到2750個(gè)蛋白卿嘲，其中646個(gè)蛋白有顯著差異表達(dá)，上調(diào)蛋白343個(gè)夫壁，下調(diào)蛋白303個(gè)拾枣。研究通過注釋到涉及氧化還原酶、能量代謝、磷酸肌醇代謝梅肤、磷酸戊糖途徑等系統(tǒng)中篩選出上調(diào)（下表1）和下調(diào)（下表2）與Cr(VI)還原和耐受相關(guān)的關(guān)鍵蛋白司蔬。

對646種差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能分類，一些與代謝過程姨蝴、細(xì)胞過程俊啼、細(xì)胞部分、細(xì)胞左医、催化活性授帕、結(jié)合等功能有關(guān)的重要蛋白質(zhì)在馴化的CM01顯著上調(diào)（下圖1）。通過KEGG分類對這些蛋白的相關(guān)代謝組學(xué)途徑進(jìn)行分析浮梢，在上調(diào)和下調(diào)的差異蛋白中萝嘁，有四種功能注釋相同的途徑求橄，分別是“代謝途徑”、“次生代謝產(chǎn)物的生物合成”映砖、“不同環(huán)境下的微生物代謝”和“ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體”欢伏，其中涉及“在不同環(huán)境中微生物代謝”的蛋白主要是下調(diào)蛋白贩猎，這表明它可能在馴化的CM01對Cr(Ⅵ)脅迫的抗性中發(fā)揮重要作用（下圖2）歌焦。

KEGG通路富集分析顯示不同功能通路下差異顯著的蛋白分布淮捆，其中代謝通路、糖酵解/糖異生躯护、磷酸戊糖途徑和肌醇磷酸鹽代謝均顯著富集（下圖3）霎苗。

Table 1.?Cr(VI)還原和耐受相關(guān)的上調(diào)蛋白

Table 2.?Cr(VI)還原和耐受相關(guān)的下調(diào)蛋白

Figure 1.差異蛋白的功能進(jìn)行注釋? ? ? ??

Figure 2.差異蛋白通路注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖

Figure 3.差異蛋白通路富集分析顯著性統(tǒng)計(jì)圖

接下來作者通過分析Cr(Ⅵ)-脅迫相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能注釋, 根據(jù)CM01蛋白差異表達(dá)結(jié)果，選取7個(gè)可能在Cr(Ⅵ)還原和耐受中發(fā)揮重要作用的蛋白做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)榛做。（鐵蛋白（ftnA）能夠增強(qiáng)機(jī)體耐受性，雙功能多粘菌素抵抗蛋白（ArnA）在細(xì)胞的滲透屏障起關(guān)鍵作用内狸，硫酸鹽饑餓誘導(dǎo)蛋白（fliY_1）參與調(diào)控微生物的重金屬抗性检眯，谷氧還蛋白家族（grxA）在免受氧化損傷方面起著十分重要的作用，黃素氧還蛋白（fldA）是廣泛存在于原核生物中的一類重要的電子傳遞載體昆淡，與防氧保護(hù)系統(tǒng)有關(guān)锰瘸，硫氧還蛋白（trxA）在缺氧相應(yīng)條件下起著調(diào)節(jié)作用，這些蛋白先前被報(bào)道參與了微生物的氧化應(yīng)激反應(yīng)昂灵。氧化還原酶（DX900_04235）也與微生物的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)）避凝。

2、基因水平的驗(yàn)證

作者進(jìn)一步通過RT-qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量眨补。采用RT-qPCR方法驗(yàn)證ftnA管削，grxA，ArnA撑螺，fldA含思，trxA，fliY_1，DX900_04235共7個(gè)功能基因的表達(dá)水平并以gyrB的mRNA水平作為內(nèi)參（下表3）含潘，RT-qPCR結(jié)果顯示饲做，馴化CM01中7個(gè)基因的表達(dá)水平與iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致（下圖4）。

Table 3.?所有目標(biāo)基因的序列特異性引物

Figure 4.?通過RT-qPCR檢測WT CM01和馴化CM01中7個(gè)基因的表達(dá)

3遏弱、表觀實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證

作者根據(jù)iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的分析結(jié)果進(jìn)一步提出了猜想：(a) 差異蛋白中有許多蛋白與氨基酸代謝有關(guān)盆均，馴化的CM01中負(fù)責(zé)編碼疏水氨基酸的蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)了細(xì)菌對滲透脅迫的耐受性漱逸，這可能是CM01減少接觸Cr(Ⅵ)造成的細(xì)胞損傷的一種策略泪姨。（b）差異蛋白中有許多蛋白與碳水化合物代謝有關(guān)，反映了Cr(Ⅵ)對CM01碳水化合物代謝的抑制(Ⅵ)虹脯，導(dǎo)致馴化CM01經(jīng)Cr(Ⅵ)處理后的葡萄糖含量高于未經(jīng)Cr(Ⅵ)處理的CM01驴娃。(c) 許多與氧化還原和一般應(yīng)激相關(guān)的蛋白都有不同程度的上調(diào)或下調(diào)，SOD通過破壞對生物系統(tǒng)有害的自由基循集，增強(qiáng)細(xì)菌在不利環(huán)境中的耐受性和適應(yīng)性唇敞。Mn/Fe SOD顯著上調(diào)，這可能是CM01抗氧化Cr(Ⅵ)以適應(yīng)高Cr(Ⅵ)環(huán)境的一種表現(xiàn)咒彤。顯著下調(diào)Cu/Zn SOD疆柔，增強(qiáng)宿主防御功能，降低重金屬對微生物的毒性镶柱。

為了驗(yàn)證上述猜想旷档，作者分別設(shè)計(jì)了如下三個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.1細(xì)胞表面疏水性和自聚集性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞表面疏水性和自聚集性與粘附特性密切相關(guān)用Cr(Ⅵ)處理培養(yǎng)的馴化CM01的細(xì)胞表面疏水性和自聚集顯著高于未用Cr(Ⅵ)處理的那些（下圖5）歇拆。此外鞋屈，革蘭氏染色中，未加Cr(Ⅵ)處理的細(xì)胞分布均勻而加Cr(Ⅵ)處理的細(xì)胞在玻片上聚集在一起（下圖6）故觅。

3.2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量測定實(shí)驗(yàn)

經(jīng)Cr(Ⅵ)處理的馴化CM01細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量高于未經(jīng)Cr(Ⅵ)處理的CM01細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量（下圖7）厂庇。

3.3總SOD活性測定實(shí)驗(yàn)

經(jīng)Cr(Ⅵ)處理馴化的CM01的總SOD活性高于未經(jīng)Cr(Ⅵ)處理的CM01，這與iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)果中SOD蛋白表達(dá)上調(diào)相一致输吏。外源Cr的濃度對CM01的總SOD活性有影響权旷，當(dāng)Cr(Ⅵ)濃度小于60 mg/L時(shí)，細(xì)胞總SOD活性隨Cr(Ⅵ)濃度的增加而逐漸升高贯溅，當(dāng)外源Cr(Ⅵ)濃度高于60 mg/L時(shí)拄氯，細(xì)胞總SOD活性降低（下圖8）

三個(gè)表觀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CM01可以通過自聚集形成穩(wěn)定的生物膜它浅，并與表面增強(qiáng)的疏水氨基酸結(jié)合译柏，將重金屬從細(xì)胞表面分離出來，最終避免Cr(Ⅵ)的毒性效應(yīng)姐霍。在Cr(Ⅵ)作用下艇纺，CM01分解葡萄糖的能力降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)葡萄糖積累。SOD通過破壞對生物系統(tǒng)有害的自由基黔衡，增強(qiáng)細(xì)菌在不利環(huán)境中的耐受性和適應(yīng)性蚓聘。可見盟劫，CM01對重金屬的抗性是多種脅迫蛋白共同作用的結(jié)果

此外夜牡，iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)果還顯示，參與肌醇磷酸鹽代謝通路的關(guān)鍵酶上調(diào)侣签，說明CM01具有完整的肌醇代謝系統(tǒng),肌醇磷酸鹽的分解代謝可能涉及氧化和磷酸化等生物學(xué)過程塘装，以維持正常生長，應(yīng)對不利環(huán)境影所。參與UvrABC系統(tǒng)的三個(gè)蛋白均上調(diào)蹦肴，UvrABC系統(tǒng)在修復(fù)逆境脅迫引起的菌株DNA損傷中發(fā)揮了重要作用。在上調(diào)的蛋白中還發(fā)現(xiàn)了一種ATP依賴性的Lon蛋白酶猴娩，對于細(xì)菌的正常生長阴幌、對各種應(yīng)激反應(yīng)和抗生素的抵抗以及細(xì)菌的毒性都是必不可少的【碇校孔蛋白OmpC參與了大腸桿菌的高滲透脅迫過程矛双，基因ompC編碼的兩個(gè)孔蛋白表達(dá)同時(shí)上調(diào)和下調(diào)，產(chǎn)生的這種矛盾將進(jìn)一步探究蟆豫。

文章小結(jié)

作者基于iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)揭示了馴化的CM01在Cr(VI)存在下的蛋白質(zhì)組學(xué)變化议忽，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)在基因水平驗(yàn)證了從iTRAQ結(jié)果中篩選出7個(gè)可能在Cr(Ⅵ)還原和耐受中發(fā)揮重要作用的蛋白，測定細(xì)胞表面疏水性和自聚集性實(shí)驗(yàn)十减、細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量測定實(shí)驗(yàn)栈幸、總超氧化物歧化酶(SOD)活性測定實(shí)驗(yàn)等結(jié)果顯示了馴化后的CM01具有復(fù)雜的耐受Cr的生物網(wǎng)絡(luò)(Ⅵ)，這可能與以下幾個(gè)方面有關(guān): (a) CM01通過抑制碳水化合物的代謝來減少葡萄糖的消耗帮辟，是一種節(jié)能的生存模式速址。(b) 肌醇磷酸鹽代謝途徑起重要作用，可能在耐藥Cr中起重要作用织阅。(c) Cr脅迫下CM01蛋白有上調(diào)和下調(diào)，不同功能的氧化應(yīng)激蛋白的過表達(dá)和抑制增強(qiáng)了菌株在高Cr(Ⅵ)環(huán)境中的適應(yīng)性震捣。(d) CM01增強(qiáng)疏水氨基酸的生物合成以抵抗Cr(Ⅵ)荔棉。(e) 一些關(guān)鍵的系統(tǒng)和蛋白，如UvrABC系統(tǒng)蒿赢、Lon蛋白酶润樱、孔蛋白OmpC等也可能通過修復(fù)DNA損傷、改變細(xì)菌自聚集羡棵、控制膜蛋白通道等途徑參與CM01的適應(yīng)機(jī)制壹若。綜上所述，這項(xiàng)研究表明了CM01在Cr(Ⅵ)脅迫下能夠存活是多種機(jī)制的綜合結(jié)果，為細(xì)菌在環(huán)境Cr(Ⅵ)脅迫下的潛在機(jī)制提供了新的線索店展。?

小編心得：這篇文章是一篇利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)养篓，對微生物機(jī)制研究的經(jīng)典文章，可供相關(guān)領(lǐng)域參考赂蕴。