概念
（1）GWAS：
全稱“全基因組關(guān)聯(lián)分析”，使用統(tǒng)計(jì)模型找到與性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)崎淳，用于分子標(biāo)記選擇（MAS）或者基因定位拣凹。
（2）GWAS分析的兩類性狀：
分類性狀（閾值性狀恨豁，質(zhì)量性狀）：比如抗病性，顏色等菊匿。
質(zhì)量性狀指相對性狀的變異呈不連續(xù)性捧请，呈現(xiàn)質(zhì)的中斷性變化的性狀棒搜。由1對或少數(shù)幾對主基因控制。如雞羽的蘆花斑紋和非蘆花斑紋可款、角的有無、毛色筋讨、血型等都屬于質(zhì)量性狀摸恍。
連續(xù)性狀（數(shù)量性狀）：比如株高，體重壁袄，產(chǎn)量等等（一般是呈現(xiàn)正態(tài)分布）
數(shù)量性狀指相對性狀的變異呈連續(xù)性媚媒，個(gè)體之間的差異不明顯，很難明確分組栈顷。受微效多基因控制萄凤，控制數(shù)量性狀的基因稱為數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait loci, QTLs)搪哪。在 QTLs 中, 基因的效應(yīng)也有大有小。其中, 效應(yīng)較大的稱為主效QTL, 效應(yīng)較小的稱為微效QTL(或微效多基因)颤难。動(dòng)植物的許多重要經(jīng)濟(jì)性狀都是數(shù)量性狀行嗤，如作物的產(chǎn)量垛耳、成熟期，奶牛的泌乳量栈雳，棉花的纖維長度缔莲、細(xì)度等等。
（3）GWAS的分析方法：
分類性狀：logistic 回歸模型等
連續(xù)性狀：GLM蛀骇，MLM 模型等
分析工具準(zhǔn)備
（1） 準(zhǔn)備文件
全基因組參考序列
全基因組注釋文件
樣本重測序文件（雙端測序）200個(gè)樣本左右或以上
（2）各類軟件和包
性狀分析
R 和 Rstudio
psych R包
lme4 R包
pheatmap R包
reshape2 R包
CMplot R包（繪制 snp 密度圖）
分析流程
（1） 表型數(shù)據(jù)分析處理
將得到的表型數(shù)據(jù)（一般是數(shù)量性狀數(shù)據(jù)）進(jìn)行分析處理
對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)擅憔，繪制直方圖觀察數(shù)據(jù)是否存在不合適的樣本數(shù)據(jù)
繪制箱線圖，觀察離群樣品數(shù)據(jù)
檢測正態(tài)性
剔除不合適的樣本
（2） 原始數(shù)據(jù)處理（識(shí)別樣本中 snp 位點(diǎn)）
fastp 原始reads 質(zhì)控
bwa men 基因組比對
gatk4 變異檢測
（3）基因型過濾（網(wǎng)上教程大多數(shù)是從這一步開始蚌讼，有 vcf 文件篡石，或者將 vcf 文件轉(zhuǎn)換后的 plink 格式的文件笛洛，bed,bim,fam 文件）
如果是vfc文件
使用 vcftools 過濾 （關(guān)于其參數(shù)設(shè)置的問題有待研究乃坤，一般是過濾掉低于缺失率高于50%的位點(diǎn)湿诊，次等位基因深度低于3。在實(shí)際中仿畸，要更嚴(yán)格，篩除第二等位基因率（次等位基因）頻率小于5%（在國際人類基因組單體型圖計(jì)劃（HapMap）中朗和，MAF大于0.05 （5%）的SNP都被作為了調(diào)查目標(biāo)），缺失率大于10%,等位基因的個(gè)數(shù)要有兩個(gè)——這個(gè)可以調(diào)整）
使用 vcftools 將過濾后的文件轉(zhuǎn)換為 plink 格式的文件（或者使用 plink 也可以直接轉(zhuǎn)換）眶拉，主要得到的是 bed 文件。
plink格式的文件主要有兩組五種
ped 和 map 是一組的
bed fam bim 是一組的
兩組可通過 plink -recode 參數(shù)相互轉(zhuǎn)換
轉(zhuǎn)換后可以使用plink再次過濾（對于計(jì)算不同的東西忆植，如群體結(jié)構(gòu)Structure要求位點(diǎn)要少一些篩選的條件就不一樣）
（4）群體結(jié)構(gòu)分析
分析之前需要進(jìn)行第三步的標(biāo)記篩選，然后根據(jù)以下條件去再次篩選：（一般只要按照LD去篩選就可以）
一定的物理距離取一個(gè)標(biāo)記作為代表進(jìn)行分析
全基因組上抽取一部分標(biāo)記進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)的分析
按 LD 篩選朝刊，LD強(qiáng)度大于一定閾值的標(biāo)記只保留其中一個(gè)用于分析
數(shù)據(jù)過濾，使用 plink 進(jìn)行缺失和 maf 篩選
LD 篩選使用 plink 按照 LD 進(jìn)行篩選
格式轉(zhuǎn)換拾氓，然后使用 recode 參數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換并得到 str 相關(guān)矩陣文件（后續(xù)就用該文件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析）（可以根據(jù)需求轉(zhuǎn)換成 structure 或者 admixture 格式，structure比較麻煩一些）
利用得出的structure 或者 admixture 格式文件計(jì)算出最適 K 值咙鞍，并在 R 中繪制不同 K 值時(shí)最低交叉驗(yàn)證誤差的變化
繪制 structure 結(jié)構(gòu)圖（有些文章把這個(gè)省略掉了，根據(jù)文章的側(cè)重不同可選擇保留）
PCA分析易阳，計(jì)算 PCA 矩陣（還可以通過EIGENSTRAT軟件計(jì)算主成分，計(jì)算各個(gè)主成分是否有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義拒课，將P值小于0.05的主成分計(jì)算在內(nèi)）早像，然后繪制 PCA 圖
（5）親緣關(guān)系分析
可用于親緣關(guān)系分析的工具有很多肖爵，如：GCTA，LDAK冀自，SPAGeDi熬粗，EIGENSOFT余境，TASSEL，現(xiàn)在使用 TASSEL 比較多
GCTA含末，LDAK 常用于 snp 遺傳力估計(jì)或者性狀遺傳力的估計(jì)
同樣需要前期使用 plink 進(jìn)行合理篩選
使用相應(yīng)軟件進(jìn)行親緣關(guān)系矩陣計(jì)算（TASSEL 可以使用界面版也可以使用命令行版本）
計(jì)算PCA矩陣（還可以通過EIGENSTRAT軟件計(jì)算主成分佣盒，計(jì)算各個(gè)主成分是否有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義侥涵，將P值小于0.05的主成分計(jì)算在內(nèi)），繪制 PCA 圖
結(jié)果可視化（ kinship 值的分布圖和 kinship 熱圖）
（6）關(guān)聯(lián)分析
使用 tassel 進(jìn)行 GLM/MLM/CMLM 分析(分為界面版和 Linux 版本务豺，界面版操作比較方便笼沥，但是用慣了 Linux 系統(tǒng)的肯定不會(huì)選界面版)
（這里要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模热珞w色馆纳，生長汹桦，低氧等）
界面版可以參考 tassel 使用說明書舞骆，下面主要講 Linux 操作
首先要對 vcf 文件進(jìn)行排序，這里用到的是一個(gè) perl 腳本脆霎，不排序后面操作會(huì)報(bào)錯(cuò)
轉(zhuǎn)換成 hapmp 格式狈惫，也可以不轉(zhuǎn)換直接操作，注意后面的參數(shù)設(shè)置就行
進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析（ GLM 和 MLM ）
對 tassel 計(jì)算的 GLM 或 MLM 結(jié)果進(jìn)行校正忆肾，校正方法 Bonferroni 和 FDR （前者比較絕對第岖，但篩選的結(jié)果一定是正確的试溯，后者可能會(huì)保留一些有意義的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，看情況使用）
FDR 校正键袱，在 R 中使用 p.adjust 函數(shù)進(jìn)行
Bonferroni 校正比 FDR 嚴(yán)格摹闽，得到的有效 SNP 位點(diǎn)會(huì)少一些
這里可以參考之前我寫的關(guān)于兩者的區(qū)別
使用 CMplot 包進(jìn)行結(jié)果可視化，曼哈頓圖澜汤，QQplot（QQplot應(yīng)該是在校正前做出來還是校正后舵匾？）
篩選有意義的 SNP 位點(diǎn)（包括潛在有意義的位點(diǎn)）
計(jì)算膨脹系數(shù)lambda
基因組膨脹因子λ定義為經(jīng)驗(yàn)觀察到的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分布與預(yù)期中位數(shù)的中值之比坐梯，從而量化了因大量膨脹而造成結(jié)果的假陽性率。換句話說谎替，λ定義為得到的卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的中值除以卡方分布的預(yù)期中值。預(yù)期的P值膨脹系數(shù)為1挫掏，當(dāng)實(shí)際膨脹系數(shù)越偏離1秩命，說明存在群體分層的現(xiàn)象越嚴(yán)重硫麻，容易有假陽性結(jié)果，需要重新矯正群體分層拿愧。
（7） 根據(jù) GWAS 結(jié)果 找到 QTL區(qū)域（這個(gè)后面的操作就了解的比較少了,后面學(xué)到了會(huì)再補(bǔ)充）
利用 R/qtl 軟件 MapQTL 軟件等定位 QTL
根據(jù) QTL 定位找到相關(guān)性狀的基因 （這個(gè)是用什么軟件浇辜？）
根據(jù)基因的位置和功能來反向驗(yàn)證結(jié)果（這里是不是要用富集分析之類的？）
后面還有一連串對 QTL 的分析
（8） 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也有很多種待诅，敲除熊镣，抑制基因表達(dá)，定量PCR等
