RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics
RNA-Seq:轉(zhuǎn)錄學的革命性工具
轉(zhuǎn)錄組研究：從芯片到RNA-Seq
摘要：
　　新一代測序技術在爆炸式發(fā)展的同時枕稀，也衍生出許多其他技術創(chuàng)新谜嫉。RNA深度測序（RNA-Seq）就是其中之一凹联，這項技術使我們對細胞發(fā)育及其調(diào)控機制的理解沐兰，達到了前所未有的深度和廣度蔽挠。盡管研究細胞RNA并不是什么新鮮事，但RNA-Seq的出現(xiàn)大大拓展了轉(zhuǎn)錄組研究的規(guī)模澳淑，取得了累累碩果，這些是傳統(tǒng)技術難以企及的杠巡。
生物通報道：新一代測序技術在爆炸式發(fā)展的同時，也衍生出許多其他技術創(chuàng)新蚌铜。RNA深度測序（RNA-Seq）就是其中之一嫩海，這項技術使我們對細胞發(fā)育及其調(diào)控機制的理解，達到了前所未有的深度和廣度出革。盡管研究細胞RNA并不是什么新鮮事，但RNA-Seq的出現(xiàn)大大拓展了轉(zhuǎn)錄組研究的規(guī)模耳璧，取得了累累碩果展箱，這些是傳統(tǒng)技術難以企及的旨枯。
轉(zhuǎn)錄組通常是指一個細胞中的所有轉(zhuǎn)錄本，特定發(fā)育階段或生理條件下的轉(zhuǎn)錄本可以揭示許多寶貴的生物學信息攀隔。轉(zhuǎn)錄組學研究可以對細胞/組織的全部/部分轉(zhuǎn)錄組進行分析栖榨。例如，分析細胞的RNA組成并加以注釋（包括編碼和非編碼的轉(zhuǎn)錄本）婴栽；檢測基因結構（外顯子/內(nèi)含子邊界、轉(zhuǎn)錄啟示位點映皆、剪切模式、基因融合事件等等）捅彻；幫助人們定位基因互作網(wǎng)絡等等。不過目前最普遍的應用是从隆，通過轉(zhuǎn)錄組研究來確定不同條件下轉(zhuǎn)錄本表達模式的改變，尋找并驗證新生物學指標广料。
自二十世紀九十年代中期以來幼驶，芯片就是進行高通量基因組表達分析的中堅力量韧衣。這一過程包括：抽提RNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA畅铭、擴增、熒光標記和片斷化假残。這些cDNA克隆隨后被用于芯片檢測炉擅，芯片上布滿了相應的DNA探針。
芯片上的探針可以代表生物整個基因組或部分基因組谍失，例如外顯子、miRNA或單核苷酸多態(tài)性SNP等等快鱼。芯片上各點的信號強弱，代表了該探針目的基因（蛋白）的表達量线罕∏耘校“這一切以雜交為中心，是一種高靈敏高特異性的途徑兢孝。芯片檢測的結果很容易釋讀仅偎，誤差很小雳殊，” 美國國家兒童醫(yī)療中心的遺傳醫(yī)學研究中心主任Eric Hoffman說。
為了尋找影響Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥的調(diào)節(jié)子座咆，Hoffman設計并訂制了一個芯片〗樘眨“我們通過這一芯片色建，可以專注于分析改變了蛋白質(zhì)的多態(tài)性，從而縮小范圍箕戳，使結果更易于解讀，”他解釋道玻墅。
芯片技術的最大局限是壮虫，構建芯片需要已知的基因組信息。對于基因數(shù)據(jù)庫中沒有的非編碼RNA和未測序生物的RNA囚似，就無法用芯片技術來檢測其轉(zhuǎn)錄情況慨绳。可見搬素，芯片技術并不是探索未知領域的理想工具。此外熬尺，芯片檢測的動態(tài)范圍較窄，這意味著你往往必須在高豐度轉(zhuǎn)錄本和低豐度轉(zhuǎn)錄本中做出選擇粱哼，而罕見轉(zhuǎn)錄本的檢測并不容易。除非進行特殊設計胯舷，一般芯片無法鑒別剪切突變或等位基因特異性突變。而且由于存在交叉反應桑嘶，用芯片法檢測高度相關的RNA種類也并不理想。
RNA-Seq
上述問題在RNA-Seq技術出現(xiàn)后讨便，得到了極大改善以政。RNA-Seq技術可對樣本中所有轉(zhuǎn)錄本進行多重測序，不論是否存在參考基因組盈蛮，都可以獲得精確到堿基的整個轉(zhuǎn)錄組。隨著測序技術的成本持續(xù)走低眉反，RNA-Seq正迅速成為研究基因組表達情況的首選途徑穆役。該技術能夠呈現(xiàn)五個數(shù)量級的表達水平差異，還能檢測外顯子梳杏、等位基因突變以及非編碼RNA等等淹接。
不同RNA-Seq平臺的讀取長度不同，從36bp到400bp不等塑悼。不論是否存在參考基因組，這這些讀段都可以通過軟件定位霞势，重新構成全長的轉(zhuǎn)錄本斑鸦。
通過RNA-Seq實驗可以獲得相當驚人的數(shù)據(jù)量，而這恰恰是一柄雙刃劍巷屿。豐富的數(shù)據(jù)量蘊含著大量的寶貴信息，但這樣的數(shù)據(jù)需要進行復雜而耗時的生物信息學分析憨琳，才能從中提取到有意義的結果。因此篙螟，人們往往會在實驗中進行一些預處理，以簡化數(shù)據(jù)釋讀慢味，例如事先挑選或去除poly-A RNA。盡管如此纯路，RNA-Seq所生成的數(shù)據(jù)仍然比芯片要多上幾個數(shù)量級寞忿。
“許多RNA測序研究都在實驗設計和結果釋讀上遇到了麻煩，” Hoffman警告說腔彰。“RNA-Seq生成的數(shù)據(jù)量更大搓逾，靈敏度更高杯拐，動態(tài)范圍更廣，但這并不等于你的問題就一定能得到順利解決端逼。”
（Josh P. Roberts撰寫/生物通編譯）

參考文獻：
RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics
http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n1/abs/nrg2484.html
RNA-Seq is a recently developed approach to transcriptome profiling that uses deep-sequencing technologies. Studies using this method have already altered our view of the extent and complexity of eukaryotic transcriptomes. RNA-Seq also provides a far more precise measurement of levels of transcripts and their isoforms than other methods. This article describes the RNA-Seq approach, the challenges associated with its application, and the advances made so far in characterizing several eukaryote transcriptomes.