瓊脂糖凝膠電泳
【原理】兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用驼修。
瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力伍俘，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大邪锌，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量癌瘾，而且還取決于分子大小觅丰，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大妨退，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)其分子篩效應(yīng)微不足道妇萄，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中蜕企。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷冠句，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)轻掩。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷懦底，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)唇牧。
【核酸分子是兩性解離分子，在高于其等電點(diǎn)的電泳緩沖液 中聚唐，其堿基不解離丐重，而磷酸基團(tuán)全部解離，核酸分子因而帶負(fù)電荷杆查，電泳時(shí)向正極遷移扮惦。也就是說(shuō) —— DNA上有磷酸根，在一般情況下帶負(fù)電亲桦，所以必然朝正電方向前進(jìn)】
一崖蜜、制配膠
2豫领、稱(chēng)量瓊脂糖 g 于錐形瓶中，加入 的TAE電泳緩沖液溶解舔琅，用微波爐加熱3min（直至液體透明）氏堤，溫度以盡量不燙手背為準(zhǔn)，加染料（有毒）
- 1μl：10ml = 染料 ： 溶解液
【加入過(guò)程中注意：瓊脂糖粉在微波爐中加熱時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)搏明，每次當(dāng)溶液起泡沸騰時(shí)停止加熱，否則會(huì)引起溶液過(guò)熱暴沸闪檬，造成瓊脂糖凝膠濃度不準(zhǔn)星著，也會(huì)損壞微波爐。溶解瓊脂糖時(shí)粗悯，必須保證瓊脂糖充分完全溶解虚循，否則，會(huì)造成電泳圖像模糊不清】
3样傍、搖晃均勻横缔，勿起氣泡，緩慢沿著一邊倒入衫哥，勿起氣泡茎刚、勿起氣泡、勿起氣泡撤逢√哦В可把梳子拔起再插粮坞。
4、等待大概30分鐘 - 1小時(shí)左右
二初狰、上樣
1莫杈、根據(jù)你想要的量來(lái)進(jìn)行跑。例如：10μl 樣品奢入，4筝闹、6μl Mark，用微量移液槍小心加入樣品槽中腥光。
【用微量移液槍小心加入樣品槽中关顷，每加完一個(gè)樣品要更換槍頭，以防止互相污染柴我，注意上樣時(shí)要小心操作解寝，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿】
三、電泳
1艘儒、加完樣后聋伦，合上電泳槽蓋，立即接通電源界睁【踉觯控制電壓保持在110 V，電流在40 mA以上翻斟。橫壓跑
2逾礁、當(dāng)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2 cm時(shí)（約40 min），停止電泳访惜。
3嘹履、打開(kāi)電腦和觀測(cè)儀器， 紫外下拍照并觀察债热。
注：PCR產(chǎn)物跑完膠結(jié)束后可放到4℃冰箱
備注：
1砾嫉、凝膠厚度和孔徑大小
一般而言， 較厚的凝膠 運(yùn)行過(guò)程中產(chǎn)生熱量也較多窒篱，可導(dǎo)致條帶擴(kuò)散焕刮。 由于凝膠染色的高背景或凝膠染色和/或脫色所需時(shí)長(zhǎng)(如進(jìn)行 電泳后染色 )，可能會(huì)出現(xiàn)可視化不佳的情況墙杯。 對(duì)于 瓊脂糖 凝膠配并，厚度以3 - 4 mm為佳，不推薦超過(guò)5 mm厚度的凝膠高镐。 聚丙烯酰胺凝膠 的厚度由制造商提供的用于凝膠灌制的墊片決定溉旋，最常見(jiàn)的是0.75 mm,1.0 mm,1.5 mm。
由 膠梳形狀決定的 孔徑大小嫉髓，不僅影響樣品的裝載量低滩，而且會(huì)影響條帶的分辨率召夹。 雖然較大的孔可容納更大的樣品負(fù)載，但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生粗條帶恕沫，減少條帶分辨率并產(chǎn)生污點(diǎn)监憎。 而長(zhǎng)而窄的孔可容納的樣品量雖小，但可提供更清晰的條帶婶溯，以獲得更好的分辨率鲸阔。 減少高密度樣品的進(jìn)樣量可提供更高強(qiáng)度的條帶。
2迄委、跑電泳的時(shí)間
電泳的時(shí)間短褐筛，不同長(zhǎng)度片段的DNA條帶還未分離，都聚集在一起叙身，所以只能看見(jiàn)DNA含量最高的主帶渔扎；而電泳時(shí)間比較長(zhǎng)，不同長(zhǎng)度片段的DNA條帶已經(jīng)分離信轿，可以清晰看到不同長(zhǎng)度片段的DNA條帶晃痴。
3、跑出的DNA帶模糊
- DNA降解：避免核酸酶污染财忽。
- 電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液多次使用后倘核，離子強(qiáng)度降低，pH值上升即彪，緩沖能力減弱紧唱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液隶校。
- 所用電泳條件不合適:電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm漏益，溫度＜30℃；巨大DNA鏈電泳深胳，溫度應(yīng)＜15℃遭庶；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。
- DNA上樣量過(guò)多：減少凝膠中DNA上樣量稠屠。
- DNA樣含鹽過(guò)高：電泳前通過(guò)乙醇沉淀去除過(guò)多的鹽。
- 有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白翎苫。
- DNA變性：電泳前勿加熱权埠，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。
