前面我們簡(jiǎn)單介紹過(guò)m6A RNA甲基化修飾特征,以及RNA m6A修飾發(fā)文套路大揭秘搪缨。那么今天小天就和大家一起探討一下纲堵，m6A甲基化數(shù)據(jù)分析的基本流程猫十。
m6A背景知識(shí)
目前已知有100多種RNA修飾坤学，涉及到mRNAs、tRNAs、rRNAs、small nuclear RNA (snRNAs) 以及 small nucleolar RNAs (snoRNAs)等冤灾。其中甲基化修飾是一種非常廣泛的修飾，N6-methyl adenosine (m6A)是真核生物mRNA上最為廣泛的甲基化修飾之一辕近，并存在于多種多樣的物種中韵吨。
腺嘌呤可以被編碼器（Writer）METTL3、METTL14和WTAP及其他組分組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體甲基化移宅，甲基化的腺嘌呤可以被讀碼器（Reader, 目前發(fā)現(xiàn)m6A讀碼器主要有五個(gè)归粉，定位于細(xì)胞核內(nèi)的YTHDC1以及定位在細(xì)胞質(zhì)中的YTHDF1、YTHDF2漏峰、YTHDF3糠悼、YTHDC2）所識(shí)別，同時(shí)m6A可以被擦除器（Eraser ）FTO和ALKBH5這兩個(gè)去甲基化酶催化去甲基化浅乔。
在哺乳動(dòng)物mRNA中倔喂，m6A修飾存在于7000多個(gè)基因中，保守基序?yàn)镽RACH (R = G, A; H = A, C, U)童擎。m6A修飾富集在mRNA終止密碼子附近滴劲。
m6A檢測(cè)方法
最近幾年來(lái)m6A研究迅速發(fā)展攻晒，正是得益于meRIP-seq技術(shù)的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用顾复。meRIP-seq高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，能夠高效精確檢測(cè)全轉(zhuǎn)錄組不同的RNA 甲基化鲁捏，是成功發(fā)現(xiàn)RNA 甲基化機(jī)理及功能的關(guān)鍵技術(shù)芯砸。MeRIP-seq 技術(shù)將甲基化DNA 免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation， MeDIP) 技術(shù)给梅、RNA 結(jié)合蛋白免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation假丧，RIP)技術(shù)和RNA 測(cè)序(RNA sequencing，RNA-seq) 技術(shù)組合起來(lái)动羽，高精度地檢測(cè)全基因組(或全轉(zhuǎn)錄組)范圍內(nèi)的RNA 甲基化包帚。MeRIP-seq 技術(shù)采用免疫共沉淀方法，即甲基化RNA 特異性抗體與被隨機(jī)打斷的RNA 片段進(jìn)行孵育运吓，抓取有甲基化修飾的片段進(jìn)行測(cè)序(IP),同時(shí)需要平行測(cè)序一個(gè)對(duì)照(Input)樣本渴邦，對(duì)照樣本用于消除抓取帶有甲基化片段過(guò)程中的背景。然后將免疫共沉淀(IP)樣本和對(duì)照樣本中的序列片段對(duì)比(或定位)到參考基因組/ 轉(zhuǎn)錄組上拘哨，檢測(cè)RNA 甲基化位點(diǎn)谋梭。對(duì)照樣本測(cè)量對(duì)應(yīng)RNA 的表達(dá)量，本質(zhì)上是RNA-seq 數(shù)據(jù)倦青。
m6A測(cè)序數(shù)據(jù)分析流程
m6A-seq數(shù)據(jù)分析的原理和過(guò)程跟ChIP-seq十分相似瓮床，大體包括如下幾個(gè)步驟。
1. 原始read質(zhì)控
2. 比對(duì)到參考基因組
3. Peak calling
用R包exomePeak call peak
用MACS2 call peak4.Peaks注釋
用R包ChIPseeker注釋peaks
用R包Guitar注釋peaks5.差異peak鑒定
用R包exomePeak鑒定差異peak
用R包MeTDiff鑒定差異peak6.差異peak對(duì)應(yīng)基因的GO和KEGG富集分析
7.Motif分析
用Homer進(jìn)行motif分析
用MEME進(jìn)行motif分析
由于篇幅限制，小編將在后面幾期的內(nèi)容里面為大家做每一步的詳細(xì)介紹隘庄，敬請(qǐng)期待踢步。
參考資料：
