介紹
這一篇是今年發(fā)在Oncogene上的文章旭绒，作者提供了非常詳細(xì)的分析代碼喳坠。
Code used for analyses is available as a Code Ocean capsule from https://doi.org/10.24433/CO.0121060.v1. Complementary code is available from https://github.com/bischofp/single_cell_lung_adenocarcinoma.
所以我們先來看一下這篇文獻(xiàn)講了什么杏瞻，有時(shí)間的話做一下復(fù)現(xiàn)旅薄。
文獻(xiàn)解讀
1. Single-cell RNA sequencing uncovers the cellular diversity of lung adenocarcinomas
第一張圖是常規(guī)流程圖和分類圖
Fig 1A：該研究取了10個(gè)肺腺癌樣本和10和對(duì)應(yīng)的HC的肺樣本闯估，（紅色表示取了腫瘤組織株灸，藍(lán)色表示取了正常組織）對(duì)20個(gè)樣本進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序得到了133736個(gè)細(xì)胞，過濾之后得到114489個(gè)細(xì)胞
Fig 1B C：114489個(gè)細(xì)胞的UMAP圖拉鹃，B圖是按分組著色辈赋，C圖是按樣本來源著色
Fig 1D：細(xì)胞注釋得到3大類細(xì)胞（上皮鲫忍，基質(zhì)和免疫細(xì)胞），D圖整合了病人信息钥屈，腫瘤組織類型和每個(gè)人的樣本中三種細(xì)胞的比例悟民。可以看出在這幾類細(xì)胞中篷就，免疫細(xì)胞占比最多射亏，但是上皮細(xì)胞在病人間顯示出最大的異質(zhì)性。
2. Intertumoral heterogeneity of tumor epithelial cells reflects differentiation gradients
第一部分注釋出了上皮竭业，基質(zhì)和免疫三大類細(xì)胞智润，第二部分就把上皮細(xì)胞提出來進(jìn)行了進(jìn)一步分析
Fig 2A：左：所有上皮細(xì)胞的UMAP圖，左：按分組著色未辆，中：按細(xì)胞類型著色（5種上皮細(xì)胞?癌細(xì)胞）窟绷，右：按樣本來源著色；右圖上面不同細(xì)胞類型的比例咐柜〖骝冢可以看到不同病人的腫瘤細(xì)胞群異質(zhì)性較大（出現(xiàn)每個(gè)病人是單獨(dú)一團(tuán)細(xì)胞的現(xiàn)象）
Fig 2B：五種上皮細(xì)胞的marker基因氣泡圖展示
Fig 2C：不同病人的marker基因熱圖，一些基因（箭頭指出）顯示出病人腫瘤細(xì)胞的特異性
Fig 2D：免疫組化驗(yàn)證Fig 2C的結(jié)果
Fig 2E：通路活性評(píng)分提示不同病人間EGFR, TGFβ, JAK/STAT, Hypoxia 和 PI3K這些通路活性存在比較大異質(zhì)性拙友。這一張圖是用PROGENy做的
Supplemental Figure 3 E：前面都是在說不同患者間上皮細(xì)胞的異質(zhì)性为狸，為了強(qiáng)調(diào)腫瘤間的相似性，4,6,8個(gè)(而不是前面的20個(gè))PC的基因被用于UMAP降維献宫≡科剑可以看到，這時(shí)候細(xì)胞主要根據(jù)組織學(xué)類型而不是病人聚在一起姊途。
Fig 2F, Supplemental Figure 3 E F：而且the first principal component (PC1) displayed a gradient along histological grades.
PC_1被認(rèn)為代表了最主要的生物差異因素涉瘾。這里的bin是根據(jù)PC_1的數(shù)值從小到大將PC_1劃分成了10個(gè)bin，可以理解為根據(jù)細(xì)胞在PC_1這個(gè)軸上的投影(參考Supplemental Figure 3 E)從左到右把細(xì)胞均分為了10份
#導(dǎo)出行為細(xì)胞捷兰，列為metadata和前10個(gè)PC的矩陣
epi_tumor_data <- FetchData(epi_pca, c(colnames(epi_pca@meta.data), paste0("PC_", 1:10)))
#根據(jù)PC_1的值從小到大排列將PC_1分成10個(gè)bin
epi_tumor_data$bin <- cut_number(epi_tumor_data$PC_1, n = 10, labels = c(1:10))
#繪制Supplemental Figure 3 F立叛，根據(jù)每個(gè)bin的樣本來源畫圖
ggplot(epi_tumor_data, mapping = aes(x = bin, fill = factor(patient_id, levels = c("p032", "p018", "p019", "p024", "p031", "p030", "p033", "p023", "p027", "p034")))) +
geom_bar() +
theme(legend.title = element_blank()) +
scale_fill_manual(values = use_colors)
ggsave2("SuppFig3F.pdf", path = "../results", width = 30, height = 30, units = "cm")
# histological subtypes along PC1
ggplot(epi_tumor_data, mapping = aes(x = bin, fill = factor(histo_subtype, levels = c("lepidic", "acinar", "mucinuous (papillary)", "(micro)papillary", "solid", "sarcomatoid")))) +
geom_bar() +
theme(legend.title = element_blank()) +
scale_fill_manual(values = use_colors)
ggsave2("Fig2F.pdf", path = "../results", width = 30, height = 30, units = "cm")
##其他圖同理，只要有每個(gè)bin和metadata對(duì)應(yīng)的矩陣贡茅，都可以畫
Supplemental Figure 3 G：有趣的是秘蛇，SCGB3A1和SCGB3A2這兩個(gè)此前報(bào)道和肺臟發(fā)育相關(guān)的基因和PC1正相關(guān)(在Fig 2C和Supplemental Figure 3 G均有箭頭指出)。
畫這個(gè)熱圖用的基因是做RunPCA()的時(shí)候返回的基因顶考，參考：單細(xì)胞RunPCA()結(jié)果解讀
Figure 2 G：此外赁还，正常肺組織的gene signature scores along PC1顯示出和肺泡一型，二型和杯狀細(xì)胞的表達(dá)譜很強(qiáng)的正相關(guān)驹沿。
這些結(jié)果提示PC1 reflects the degree of differentiation of tumor epithelial cells. 因此艘策，與PC1positively和negatively相關(guān)的top 30 genes分別被定義為“alveolar/club-like”和“undifferentiated” tumor cell signature。(Fig. 2F–H, Supplementary Fig. 3G, H)
Supplementary Fig 3I：盡管不同分化程度的腫瘤細(xì)胞沒有顯示出明顯的分裂活性差異渊季，但是“undifferentiated”的細(xì)胞顯示出很強(qiáng)的 JAK/STAT, Hypoxia, EGFR 和TGFà通路活性朋蔫，而‘’alveolar/club cell-like”腫瘤上皮細(xì)胞具有較高的PI3K信號(hào)通路評(píng)分（Fig. 2H）罚渐。
小結(jié)：不同肺腺癌患者的腫瘤上皮細(xì)胞顯示從 “undifferentiated” 到 ‘’alveolar/club cell-like” 的轉(zhuǎn)錄模式，而且這種轉(zhuǎn)錄模式和與不同的致癌通路活性相關(guān)驯妄。
3. Two subtypes of myofibroblasts constitute the tumor stromal microenvironment
上一部分對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行了分析荷并，這一部分主要分析基質(zhì)細(xì)胞。
Figure 3 A：基質(zhì)細(xì)胞的亞群細(xì)分和比例變化青扔，分為了EC7群源织，淋巴型內(nèi)皮，F(xiàn)B2群赎懦，肌成纖維2群雀鹃，平滑肌2群幻工，間皮細(xì)胞励两。發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在一個(gè)fibroblast to myofibroblast的shift。而且肌成纖維2群幾乎只在腫瘤樣本中存在囊颅。
Figure 3 B：marker gene的DotPlot当悔。肌成纖維細(xì)胞同時(shí)表達(dá)成纖維細(xì)胞的marker PDGFRA，LUM和平滑肌的marker MYLK和ACTA2踢代。
Figure 3 C：top10. marker gene的Heatmap盲憎。可以看到肌成纖維細(xì)胞2群高表達(dá)膠原marker胳挎，比如COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL6A3和基質(zhì)蛋白VCAN以及基質(zhì)講解酶SULF1和MMP11饼疙，提示這一類細(xì)胞參與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)。
Figure 3 D：和前面Fig 2E一樣做的PROGENy慕爬，肌成纖維細(xì)胞2群顯示出高度活化的TGFà和JAK/STAT以及缺氧誘導(dǎo)信號(hào)通路窑眯，這些都是已經(jīng)有報(bào)道的腫瘤相關(guān)肌成纖維細(xì)胞的特征。
Figure 3 E：所有病人樣本中肌成纖維1群和2群的比例医窿，呈負(fù)相關(guān)磅甩。
Figure 3 F：免疫組化檢測(cè)肌成纖維2群的marker CTHRC1
小結(jié)： 肌成纖維細(xì)胞1群和2群分別代表了肌成纖維細(xì)胞“normal-like”和“cancer-associated”表型。
4. The tumor immune microenvironment exhibits pro- and non- inflammatory traits
Figure 4 A：腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞分群和比例變化姥卢。一共分了22群卷要。在這些細(xì)胞中，粒系：monocyte-derived macrophages和樹突狀細(xì)胞比例增加独榴。組織原位巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞比例下降僧叉。淋系：CD8+ T, B和漿細(xì)胞比例上升，NK和conventional T比例下降棺榔。Treg幾乎只存在于腫瘤組織瓶堕。
Figure 4 B：每個(gè)群的淋系/髓系marker基因氣泡圖
Figure 4 C：巨噬細(xì)胞群的一些模塊評(píng)分；monocyte-derived macrophage1群高表達(dá)SELENOP (Supplementary Fig. 8B)掷豺，與M2表型相關(guān)捞烟。而且這一群細(xì)胞immune response-related signatures評(píng)分較低(白色箭頭)薄声。2群則高表達(dá)一些促炎因子，如CXCL9题画，CXCL10默辨，IL1B等 (Supplementary Fig. 8B)，而且gene signatures和immune response以及M1 polarization相關(guān)苍息。這提示monocyte-derived macrophage1群和2群分別代表著抗炎和促炎狀態(tài)缩幸。
這里左邊四個(gè)pathway都是GSEA的hallmark基因集中的。
M1up和M1down的分?jǐn)?shù)來自于GSE5099_CLASSICAL_M1_VS_ALTERNATIVE_M2_MACROPHAGE_UP/GSE5099_CLASSICAL_M1_VS_ALTERNATIVE_M2_MACROPHAGE_DOWN竞思。
Figure 4 D：monocyte-derived macrophage1群和2群在病人間的比例呈負(fù)相關(guān)表谊。但促炎的2群與其他免疫細(xì)胞例如plasmacytoid DCs的比例呈正相關(guān)。
Figure 4 E：免疫組化檢測(cè)了monocyte-derived macrophages 2群 (CXCL9)和plasmacytoid DCs (CD123)盖喷，與前面結(jié)論一致爆办。
Figure 4 F：淋系細(xì)胞中，F(xiàn)igure 4 A顯示CD8+T細(xì)胞比例上升课梳，這類細(xì)胞分為4個(gè)群距辆，并分別計(jì)算了毒性和耗竭評(píng)分。tumor-enriched CD8+ T細(xì)胞1群和2群以及增殖T細(xì)胞具有比較高的耗竭評(píng)分暮刃。
Figure 4 G： tumor-enriched CD8+ T細(xì)胞1群和2群比例和促炎性monocyte-derived macrophage2群以及plasmacytoid DCs的比例正相關(guān)跨算。與Treg的比例有正相關(guān)的趨勢(shì)。
小結(jié)：we identify patient-overarching changes of the immune cell composition from normal lung tissue to adenocarcinoma, and distinct tumor immune microenvironment patterns contributing to interpatient heterogeneity.
5. The tumor microenvironment of lung adenocarcinoma features two major patterns
Figure 5 A： PCA圖顯示患者按照cellular composition of the tumor microenvironment聚在一起
Figure 5 B H： 將病人劃分為2個(gè)pattern
· N3MC pattern：P018, P019, P024, P031, P032和P033（marked by normal-like myofibroblasts, noninflammatory monocyte-derived macrophages, NK cells, myeloid dendritic cells and conventional T cells）
· CP2E pattern：P023, P027, P030和P034 （characterized by cancer-associated myofibroblasts, proinflammatory monocyte-derived macrophages, plasmacytoid dendritic cells and exhausted CD8+ T cells）
Figure 5 C D：對(duì)這兩個(gè)pattern的細(xì)胞做了互作分析椭懊，參考CellphoneDB诸蚕，發(fā)現(xiàn)CP2E環(huán)境的腫瘤細(xì)胞 receive potential paracrine signals from cancer-associated myofibroblast cluster 2 activating Ephrin, FGF, WNT, TGFβ, and BMP signaling, and from proinflammatory monocyte-derived macrophages cluster 2 potentially activating JAK/STAT signaling
為了看兩種pattern和預(yù)后的相關(guān)性，作者從TCGA上下載了533個(gè)肺腺癌患者的數(shù)據(jù)
Figure 5 G：TCGA lung adenocarcinoma cohort氧猬，發(fā)現(xiàn) N3MC 相關(guān)的gene signature預(yù)后更好
結(jié)論：免疫活化的CP2E微環(huán)境由癌癥相關(guān)的肌纖維細(xì)胞背犯，促炎單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞，血漿骨質(zhì)樹突樹突細(xì)胞和排出的CD8 + T細(xì)胞組成狂窑，并且預(yù)后不利媳板；惰性N3MC 微環(huán)境主要包括正常的肌纖維細(xì)胞，非炎癥單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞泉哈，NK細(xì)胞蛉幸，骨髓樹突細(xì)胞和常規(guī)T細(xì)胞，并與良好的預(yù)后有關(guān)丛晦。
