導(dǎo)讀

• 宏基因組分箱（Binning）是將宏基因組測序得到的混合了不同生物的序列或序列組裝得到的contigs按物種分開歸類的過程，類似下圖[1]卖宠。傳統(tǒng)的單物種全基因組序列都是經(jīng)純培養(yǎng)之后巍杈，再進行全基因組de novo測序才獲得的，但是環(huán)境中存在著大量的不可培養(yǎng)微生物扛伍，宏基因組分箱技術(shù)有助于獲得不可培養(yǎng)微生物的全基因組序列筷畦，獲得新物種的基因組序列和功能，預(yù)測未知物種的培養(yǎng)方法等等刺洒。

  
  
  分箱.png

一鳖宾、分箱工具盤點

• 早在2011年，science上的一篇文章就用了宏基因組Binning技術(shù)對來自牛瘤胃的樣本進行了宏基因組測序研究逆航。該研究從268 Gbp的宏基因數(shù)據(jù)中成功Binning出了15個不能培養(yǎng)的微生物的全基因組序列（可見分箱對數(shù)據(jù)量要求很大）鼎文。從那以后，宏基因組Binning技術(shù)開始被更多的人關(guān)注和重視纸泡，也逐漸出現(xiàn)了很多宏基因組Binning工具漂问。查了一些文獻(xiàn)和資料，我羅列了一下近幾年的分箱工具女揭，引用量僅供參考（google學(xué)術(shù)蚤假，2019.8.29）。

二吧兔、分箱工具比較

1. 2017年Nature Methods上一篇文章對宏基因組數(shù)據(jù)處理各個過程中的軟件進行了評估[ Critical Assessment of Metagenome Interpretation-a benchmark of metagenomics software ]磷仰。從文章的分析結(jié)果來看，不同的方法各有優(yōu)缺（下圖）境蔼，MaxBin2可能是相對較好的一個分箱軟件灶平。

• 比較結(jié)果：

  
  
  NM.png

2. 加利福利亞大學(xué)在通過整合多個算法設(shè)計出了新的Binning軟件DAS tool并在2018年發(fā)表在Nature Microbiology上 [ Recovery of genomes from metagenomes via a dereplication, aggregation and scoring strategy ]。集合了多個算法的DAS tool各項Binning指數(shù)要明顯優(yōu)于CONCOCT箍土，MaxBin 2逢享，MetaBAT等方法，比較分析結(jié)果如下：

• 比較結(jié)果：

  
  
  對不同樣本來源的宏基因組數(shù)據(jù)進行分箱完成度分析.png
  
  
  對模擬微生物群落進行基因組重建分析.png

3. 同年吴藻，Microbiome上發(fā)表了另一個整合了多個工具的分箱分析流程MetaWRAP [MetaWRAP—a flexible pipeline for genome-resolved metagenomic data analysis. Microbiome]瞒爬。

• MetaWRAP流程不僅納入了最流行的MetaBAT、CONCOCT和MaxBin2分箱方法沟堡，還整合了質(zhì)控侧但、拼接、分箱航罗、提煉禀横、評估、注釋等多種功能粥血。MetaWRAP可以解決分箱分析中可能遇到的絕大多數(shù)問題柏锄，而且比較分析發(fā)現(xiàn)綜合多個工具的MetaWRAP分箱法不僅比單個工具分箱效果好，也比同樣是綜合多個算法的DAS tool分箱法效果好立莉，比較分析結(jié)果如下：

• 比較結(jié)果：

  
  
  完成度和污染度的比較（CAMI數(shù)據(jù)集）.png
  
  
  完成度和污染度的比較（水绢彤、腸道、土壤數(shù)據(jù)）.png
  
  
  metaWRAP重組裝分箱效果更佳.png

三蜓耻、分箱實戰(zhàn)

• MetaWRAP集合的算法和工具很全很多茫舶，但是也很慢，有條件的話可以自己嘗試使用MetaWRAP刹淌。[Extensive Unexplored Human Microbiome Diversity Revealed by Over 150,000 Genomes from Metagenomes Spanning Age, Geography, and Lifestyle. Cell. 2019]這篇文章提到饶氏，MetaBAT2在單樣本分箱中表現(xiàn)最佳，也在Metawrap文章中表現(xiàn)不錯有勾。Metawrap看似有前途疹启，但是存在兩個缺點：1）沒有獨立驗證；2）計算成本高蔼卡『把拢考慮到時間，下面只以MetaBAT2為例簡介分箱工作流程。

1. 準(zhǔn)備

• 下面是需要的軟件和數(shù)據(jù)：

• MetaBAT2分箱工具地址：
  https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat/src/master/

• CheckM分箱質(zhì)檢地址：
  https://github.com/Ecogenomics/CheckM/wiki

• MetaBAT2測試數(shù)據(jù)地址：
  https://portal.nersc.gov/dna/RD/Metagenome_RD/MetaBAT/Software/Mockup/

測試數(shù)據(jù).png

• 下載得到已經(jīng)組裝好的contigs文件assembly.fa和兩個樣本的bam文件荤懂。

2. 統(tǒng)計contig深度

jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth depth_var.txt *.bam

• 統(tǒng)計結(jié)果：

  
  
  contigs深度.png

• 結(jié)果說明：
  第一列：contigName
  第二列：contigLen
  第三列：totalAvgDepth
  第四列：library1.sorted.bam
  第五列：library1.sorted.bam-var
  第六列：library2.sorted.bam
  第七列：library2.sorted.bam-var

3. 分箱(4線程茁裙，21秒)

time metabat2 -t 4 -i assembly.fa -a depth_var.txt -o metabat2/bin –v

• 分箱結(jié)果：

  
  
  分箱結(jié)果.png

4. 分箱評估 (4線程，32分鐘)

time checkm lineage_wf -f metabat2/checkm.txt -t 4 -x fa metabat2/ metabat2/checkm/
##  評估結(jié)果保存在checkm.txt文件中节仿。

5. 評估結(jié)果：

• 提取ID晤锥，Taxonomy，Completeness廊宪，Contamination信息：

grep 'bin' checkm.txt | sed 's/^  //' | awk '{print $1,$2,$13,$14}' | sed 's/\ /\t/g'| sed 's/\./\t/' | sort -n -k 2 | sed 's/\t/./' > test.txt
##  從checkm.txt提取

• 提取結(jié)果：

  
  
  分箱評估結(jié)果.png

第一列：Bin Id
第二列：Marker lineage
第三列：Completeness
第四列：Contamination

結(jié)束語

• 到此就完成了兩個樣本的宏基因組分箱和分箱評估工作矾瘾。這只是宏基因組分箱的簡介，更全更詳細(xì)的分箱分析可以參考MetaWRAP分析流程箭启。

• MetaWRAP分析流程地址：
  https://github.com/bxlab/metaWRAP/blob/master/Usage_tutorial.md

metawrap concoct報錯

/public/home/zzumgg03/huty/softwares/miniconda3/envs/metawrap-env/bin/concoct_coverage_table.py:48: FutureWarning: read_table is deprecated, use read_csv instead, passing sep='\t'.
  df = pd.read_table(fh, header=None)
Traceback (most recent call last):
  File "/public/home/zzumgg03/huty/softwares/miniconda3/envs/metawrap-env/bin/concoct_coverage_table.py", line 77, in <module>
    generate_input_table(args.bedfile, args.bamfiles, samplenames=samplenames)
  File "/public/home/zzumgg03/huty/softwares/miniconda3/envs/metawrap-env/bin/concoct_coverage_table.py", line 52, in generate_input_table
    avg_coverage_depth.to_csv(sys.stdout, index_label='contig', sep='\t', float_format='%.3f')
  File "/public/home/zzumgg03/huty/softwares/miniconda3/envs/metawrap-env/lib/python2.7/site-packages/pandas/core/generic.py", line 3007, in to_csv
    from pandas.io.formats.csvs import CSVFormatter
ImportError: cannot import name CSVFormatter

參考：

1. 句句干貨壕翩！一文讀懂宏基因組binning
2. Microbiome：宏基因組分箱流程MetaWRAP簡介
3. 宏基因組分箱Binning以及MaxBin的使用
4. 分箱原理