檢測器官和組織損傷對于早期診斷、治療決策和監(jiān)測疾病進展至關(guān)重要咸作。由于DNA甲基化模式可以響應(yīng)組織損傷而改變，甲基化檢測提供了一種有前途的方法宵睦，在早篩早診、疾病進展監(jiān)測墅诡、治療效果和器官移植評估等可行性方面具有潛在應(yīng)用壳嚎。組織或器官損傷后釋放到血流中的cfDNA（cell-free DNA）可以作為損傷的生物標(biāo)志物桐智。cfDNA的表觀遺傳狀態(tài)（包括DNA甲基化模式）可以提供對組織和器官損傷程度的見解。本文強調(diào)DNA甲基化作為一種廣泛研究的表觀遺傳修飾烟馅，在細胞生長说庭、分化和疾病發(fā)展等過程中起著關(guān)鍵作用。介紹了多種高度精確的5-mC甲基化檢測技術(shù)郑趁，這些技術(shù)是獲得與組織損傷相關(guān)表觀遺傳改變的深刻見解的有力工具刊驴。深入研究了器官和組織損傷中DNA甲基化變化的潛在機制，包括炎癥寡润、氧化應(yīng)激和DNA損傷修復(fù)機制捆憎。介紹了cfDNA甲基化在檢測特定器官組織和器官損傷中的研究現(xiàn)狀。最后概述了在臨床試驗中鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的特定甲基化標(biāo)記中的多個步驟梭纹。本綜述將探討基于cfDNA甲基化的檢測器官和組織損傷的機制和研究現(xiàn)狀躲惰，潛在機制以及在臨床實踐中的潛在應(yīng)用。
Introduction
檢測器官和組織損傷對于及時診斷和有效治療各種疾病和病癥至關(guān)重要变抽。早期發(fā)現(xiàn)組織損傷可以及時干預(yù)础拨，防止進一步的損傷并可能改善預(yù)后。監(jiān)測疾病進展也可以幫助告知治療決策绍载，并根據(jù)需要進行調(diào)整诡宗。此外，評估治療效果可以幫助確定干預(yù)措施是否有效击儡，并為繼續(xù)或修改治療計劃的決定提供信息僚焦。最后，在移植醫(yī)學(xué)中曙痘，檢測組織損傷對于評估移植器官的生存能力和確保受體成功結(jié)果至關(guān)重要芳悲。在此前研究中，組織切片的組織病理學(xué)檢查通常被認為是檢測組織和器官損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”边坤。然而名扛，這種方法是高度侵入性的，不適用于組織和器官損傷的早期篩查茧痒。
CpG位點是DNA上的特定區(qū)域肮韧，以C（胞嘧啶）和鳥嘌呤核苷酸命名，通過磷酸二酯鍵連接旺订。這些位點廣泛分布于整個人類基因組中弄企，對基因表達和基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要。在許多研究中区拳，CpG位點甲基化狀態(tài)與人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)拘领。DNA甲基化也因組織損傷而變化∮５鳎基于甲基化的檢測為檢測器官和組織損傷提供了一種有前途的方法约素〗炝迹基于DNA甲基化模式的表觀遺傳分析包括DNA甲基化模式的研究，以檢測可能反映組織損傷或疾病相關(guān)變化的跡象圣猎。這些測試方法具有高度的特異性和靈敏度士葫，可應(yīng)用于各種樣本類型，包括血液送悔、尿液和組織活檢慢显，促進非侵入性數(shù)據(jù)收集，并大大推進組織損傷的早期診斷欠啤〖栽澹基于甲基化的檢測方法正在研究一系列應(yīng)用，從早期發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測疾病進展到評估治療效果和評估移植器官活力跪妥。
液體活檢鞋喇，特別是血漿中循環(huán)cfDNA甲基化分析，可能成為組織損傷檢測中一種有前途的非侵入性診斷方法眉撵。血液或體液樣本的收集是一種非侵入性程序侦香，不需要組織切除或組織活檢，從而避免了傳統(tǒng)組織檢查的痛苦和風(fēng)險纽疟。大多數(shù)cfDNA片段的范圍為80-200 bp罐韩，長度對應(yīng)于核小體大小160-180 bp。起源組織解卷積是cfDNA甲基化分析中的關(guān)鍵技術(shù)污朽，使研究人員能夠根據(jù)DNA甲基化模式確定cfDNA來源散吵。該技術(shù)基于一個核心概念：不同的組織和器官在其DNA甲基化譜中具有獨特的表觀遺傳特征。因此蟆肆，當(dāng)這些組織或器官受損時矾睦，例如由于癌癥、創(chuàng)傷或其他導(dǎo)致細胞死亡的疾病炎功，它們會將cfDNA釋放到血液中（圖1A）枚冗。研究人員可以分析這些cfDNA樣本中的DNA甲基化模式，并嘗試將其與已知組織特異性DNA甲基化模式的參考數(shù)據(jù)庫進行比較蛇损。通過這種比較赁温，他們可以解卷積或確定給定cfDNA樣品來源組織或器官。這項技術(shù)的優(yōu)點是能夠以非侵入性方式檢測和監(jiān)測組織特異性損傷淤齐，而不需要傳統(tǒng)的組織活檢股囊。
如圖1B所示贫堰，組織和器官損傷后cfDNA形式的表觀遺傳標(biāo)記物釋放到血流中穆壕，使cfDNA成為評估組織和器官損傷的有價值的生物標(biāo)志物待牵。此外其屏，cfDNA的表觀遺傳狀態(tài)，包括DNA高甲基化和低甲基化模式缨该，可以提供對組織和器官損傷程度的見解偎行。總體而言贰拿，cfDNA的DNA甲基化狀態(tài)可用作組織和器官損傷的生物標(biāo)志物蛤袒。本文將研究cfDNA甲基化涉及的潛在機制，用于檢測器官和組織損傷的cfDNA甲基化模式的當(dāng)前研究現(xiàn)狀膨更，以及這些檢測在臨床實踐中的潛在應(yīng)用妙真。
表觀遺傳學(xué)和DNA甲基化
即使DNA序列保持不變，真核基因表達也通過多種機制受復(fù)雜調(diào)控荚守，這種現(xiàn)象被稱為表觀遺傳學(xué)珍德。表觀遺傳調(diào)控涉及多種機制，包括DNA甲基化矗漾、組蛋白修飾和非編碼RNA等锈候。其中DNA甲基化研究非常廣泛。
在真核生物中敞贡，DNA甲基化涉及在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下泵琳，在DNA中C的第5個碳上添加一個甲基，產(chǎn)生了5-mC（5-甲基胞嘧啶）誊役，主要位于CpG位點获列。人類基因組中約有2.8M的CpG位點，但其分布并不均勻蛔垢。CpG序列平均僅發(fā)生約1%击孩，CGI（CpG島）是密集的區(qū)域，其頻率是平均頻率的五倍以上啦桌，通常定義為超過200個堿基對長的基因組區(qū)域溯壶，GC含量超過50%，CpG比率超過60%甫男。超過60%的基因且改，包括具有組織特異性表達模式的基因，在其啟動子區(qū)域和第一外顯子中具有CpG島板驳。
在正常組織基因組中又跛，約70%的CpG位點被甲基化，而大多數(shù)CpG島未甲基化若治。一些CGI基因被甲基化慨蓝，如非活性X染色體上的基因和印跡基因感混。甲基化在各種生物過程中起著至關(guān)重要的作用，包括細胞生長礼烈、分化弧满、X染色體失活、基因組印跡此熬、基因沉默庭呜、防御外源基因以及多細胞生物中的異生素代謝。
表觀遺傳機制的研究在科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)中具有巨大意義犀忱，增強了對基因調(diào)控募谎、疾病發(fā)生和遺傳以及創(chuàng)新療法發(fā)展的理解。
DNA甲基化在器官和組織損傷中的變化機制
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）是一類在細胞中起關(guān)鍵作用的酶阴汇，可以調(diào)控DNA甲基化数冬。DNMT主要負責(zé)向DNA中的胞嘧啶殘基添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶搀庶，從而實現(xiàn)DNA甲基化拐纱。DNMT能夠與DNA結(jié)合并識別靶DNA序列，通常是CpG地来。一旦DNMT與靶DNA序列結(jié)合戳玫，它們就會將甲基從SAM供體轉(zhuǎn)移到DNA中的胞嘧啶堿基。該過程涉及形成共價鍵未斑，將甲基添加到胞嘧啶堿基的第五個碳原子上咕宿，產(chǎn)生5-mC。DNMT1（DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1）作為維持DNMT蜡秽，主要任務(wù)是在DNA復(fù)制和細胞分裂過程中維持DNA甲基化穩(wěn)定性府阀。DNMT1可以識別新合成的未甲基化DNA鏈，并在DNA復(fù)制過程中添加甲基芽突，以確保每一代細胞中DNA甲基化模式的正確遺傳试浙。DNMT3A和DNMT3B是de novo的DNMT，負責(zé)在細胞分化和發(fā)育過程中引入新的DNA甲基化寞蚌。這些酶可以將甲基引入特定基因或基因組區(qū)域田巴，從而調(diào)控基因表達并影響細胞功能。
DNA去甲基化：除DNMT外挟秤，DNA去甲基化酶（如TET（10-11易位））也是DNA甲基化動態(tài)平衡的關(guān)鍵組成部分壹哺。TET酶可以從DNA中去除甲基，將5-mC轉(zhuǎn)化為5hmC（5-羥甲基胞嘧啶）艘刚，并參與DNA去甲基化過程管宵。AID（activation-induced cytidine deaminase，活化誘導(dǎo)的胞嘧啶脫氨酶）和AB（Apobec）是脫氨酶，通常與DNA堿基脫氨和脫氧核糖修飾有關(guān)箩朴，而不是直接參與DNA甲基化或去甲基化反應(yīng)岗喉。它們在改變DNA堿基方面起作用，例如將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶炸庞，而不涉及DNA甲基的添加或去除钱床。TDG（胸腺嘧啶DNA糖基化酶）和SMUG1（單鏈選擇性單功能尿嘧啶DNA糖基化酶1）是與DNA修復(fù)相關(guān)的兩種酶，在維持DNA堿基的完整性和糾正DNA堿基錯誤方面起著至關(guān)重要的作用燕雁。這些酶向DNA分子引入脫氨或脫氧核糖基化等變化诞丽，影響DNA甲基化狀態(tài)鲸拥。組織和器官損傷可以通過各種機制調(diào)控DNMT和DNA去甲基化酶拐格，從而影響DNA甲基化狀態(tài)，包括炎癥刑赶、氧化應(yīng)激和DNA損傷修復(fù)機制捏浊。這些機制可以相互作用，引起DNA甲基化模式的復(fù)雜變化撞叨，并導(dǎo)致?lián)p傷和疾病的持續(xù)（圖2）金踪。
炎癥
在組織和器官損傷后枷餐，身體啟動炎癥反應(yīng)以清除受損的細胞和組織靶瘸，促進修復(fù)和再生。然而毛肋，這種炎癥反應(yīng)也可能導(dǎo)致DNA甲基化變化怨咪，因為炎癥反應(yīng)可以產(chǎn)生活性氧（ROS），亞硝酸鹽和其他可能直接或間接影響DNA甲基化的有害物質(zhì)润匙。炎癥還可以激活免疫細胞诗眨，導(dǎo)致細胞因子和其他信號分子的分泌，從而改變DNA甲基化模式孕讳。例如匠楚，IL-6（細胞因子白細胞介素-6）和STAT3（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3）已被證明可增加DNMT活性，從而導(dǎo)致某些基因的DNA甲基化增加厂财。過量的IL-15（細胞因子白細胞介素-15）在動物模型中誘導(dǎo)DNMT3b（DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-3b）上調(diào)和整體DNA高甲基化芋簿。
氧化應(yīng)激
由于受損細胞釋放的自由基、過氧化物和其他氧化劑蟀苛，組織和器官損傷可能會增加細胞氧化應(yīng)激益咬，可能會破壞DNA并改變調(diào)控DNA甲基化的酶活性。例如，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致DNMT氧化幽告，導(dǎo)致活性改變和DNA甲基化模式改變梅鹦。在最近對Graves病患者外周血單核細胞的研究中，發(fā)現(xiàn)活性氧增加導(dǎo)致DNMT1表達增加冗锁，反過來又與促進Graves病自身免疫的免疫調(diào)控基因異常甲基化模式有關(guān)齐唆。類似地，在多柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性的研究中，多柔比星誘導(dǎo)心臟細胞損傷和氧化應(yīng)激贞间，其產(chǎn)生自由基和一氧化氮以響應(yīng)應(yīng)激恋博。氧化應(yīng)激增加并下調(diào)DNMT1酶活性，導(dǎo)致DNA甲基化的線粒體功能障礙锭弊。氧化應(yīng)激還可以改變從DNA中去除甲基的酶（如TET酶）活性，從而導(dǎo)致DNA甲基化模式變化擂错。在多囊卵巢綜合征疾病研究中構(gòu)建的細胞損傷模型中味滞，發(fā)現(xiàn)細胞損傷降低了TET水平并導(dǎo)致細胞甲基化水平升高。
DNA損傷修復(fù)
DNA損傷是組織和器官損傷的常見后果钮呀，DNA修復(fù)機制被激活以修復(fù)損傷剑鞍。DNA修復(fù)過程可以影響DNA甲基化模式，因為一些DNA修復(fù)酶可以改變DNA甲基化水平爽醋。例如蚁署，PARP1酶（聚（ADP-核糖）聚合酶-1）是一種參與DNA修復(fù)、染色質(zhì)重塑和基因表達的核酶（nuclear enzyme）蚂四，可以催化甲基全基因組染色質(zhì)去除光戈。PARP1與染色質(zhì)全基因組的結(jié)合與DNA甲基化模式互斥，表明PARP1與DNA甲基化之間存在功能互作证杭。事實上田度，抑制PARylation會導(dǎo)致DNA甲基化模式的全基因組變化。DNA雙加氧酶AlkB也可以調(diào)控DNA甲基化水平解愤，AlkB可以通過在Fe（II）離子镇饺，α-KG和氧氣存在下的氧化去甲基化機制將m3C和m1A直接轉(zhuǎn)化為未甲基化堿基。在一項血液疾病研究中送讲，生發(fā)中心的B細胞在DNMT1幫助下分化奸笤，改變其DNA模式以正確分化。DNMT1在DNA甲基化和雙鏈斷裂修復(fù)中發(fā)揮雙重作用哼鬓。
總之监右，組織和器官損傷可以通過多種機制引起DNA甲基化模式變化，這些機制可以互作以產(chǎn)生DNA甲基化模式的復(fù)雜變化异希。
cfDNA甲基化檢測特異性組織及器官損傷的研究現(xiàn)狀
基于cfDNA甲基化的檢測在檢測組織和器官損傷方面具有巨大潛力健盒，該領(lǐng)域的進一步研究可以為各種組織和器官疾病提供新的診斷和預(yù)后工具。以下描述了cfDNA甲基化在檢測特定器官組織和器官損傷中的研究現(xiàn)狀（表1）。
肝臟
基于肝源性cfDNA甲基化檢測方法已被用于檢測各種情況下的肝損傷扣癣，包括乙型肝炎和丙型肝炎感染惰帽、非酒精性脂肪肝、肝細胞癌和肝移植父虑。Miguel Waterhouse等人使用數(shù)字液滴PCR檢測cfDNA中PTK28基因特異性甲基化標(biāo)記该酗，以檢測急性移植物抗宿主病患者的肝組織損傷。區(qū)分肝臟中aGvHD（急性移植物抗宿主彩亢俊）和非aGvHD（非急性移植物抗宿主参仄恰）的閾值為1.5（靈敏度=0.928；特異性=0.910）莱衩，肝損傷aGvHD的臨床改善導(dǎo)致甲基化PTK2B濃度降低爵嗅。在另一項關(guān)于癌癥對宿主組織損害的研究中，發(fā)現(xiàn)受癌癥影響的器官中細胞死亡可以通過cfDNA組織特異性甲基化模式來檢測膳殷。在肝細胞癌研究中操骡，通過Illumina Infinium 450k芯片鑒定了三種肝組織甲基化特異性標(biāo)志物（cg02396797/ cg030646442/cg21178851）。與健康供體赚窃、局部癌癥患者或非肝轉(zhuǎn)移性疾病患者相比，肝轉(zhuǎn)移患者表現(xiàn)出更高水平的肝細胞來源cfDNA岔激，無論是通過肝細胞來源cfDNA比例或每毫升肝細胞基因組當(dāng)量來檢測勒极。使用561（基因組當(dāng)量/mL）的肝源性特異性cfDNA標(biāo)記物，檢測肝轉(zhuǎn)移和肝損傷的特異性和靈敏度分別為95%和35%虑鼎。此外辱匿，肝細胞cfDNA水平能夠區(qū)分有無肝轉(zhuǎn)移的4期癌癥患者（AUC=0.81，95%置信區(qū)間0.73-0.89炫彩，P<0.0001）匾七。另一項研究描述了一種通過基于攜帶肝細胞特異性甲基化模式的cfDNA片段的定量鑒定肝細胞中特異性非甲基化的三個基因組位點（ITIH4，IGF2R和VTN）來檢測急性肝細胞死亡的方法江兢。通過ddPCR分析了來自健康個體昨忆、肝移植患者、肝臟供體杉允、敗血癥患者和杜興氏肌營養(yǎng)不良癥的血液樣本邑贴，結(jié)果表明，這三種肝細胞來源的cfDNA分析可以提供有關(guān)肝細胞死亡的特定和敏感信息叔磷。它提供了肝損傷的近實時指示拢驾，并可以動態(tài)監(jiān)測肝損傷。
腎臟
基于甲基化的檢測方法已越來越多地用于檢測腎臟損傷并了解與腎臟疾病相關(guān)的潛在分子機制改基。在腎臟患者中觀察到特定基因啟動子區(qū)域的高甲基化繁疤。在人類急性腎損傷的研究中，通過焦磷酸測序評估了健康對照組和急性腎損傷患者尿液和全血中cfDNA的KLK1基因啟動子區(qū)四個位點的甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明稠腊，AKI患者血液和尿液中甲基化的KLK1基因啟動子在全基因組模式中高于健康對照組（P<0.0001）案疲，表明KLK1基因甲基化有可能成為監(jiān)測腎損傷的標(biāo)志物。在另一項研究中麻养，手術(shù)后第二天褐啡，通過定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測到13名死者和10名活體腎移植受者以及65名健康對照者尿液DNA中兩個基因啟動子（DAPK和CALCA）的異常甲基化，移植受者尿液中發(fā)現(xiàn)CALCA基因啟動子異常甲基化的可能性明顯高于健康對照組（100%比31%鳖昌；P<0.0001）备畦。與活體供體移植相比，死亡患者尿液中鈣質(zhì)高甲基化增加（21.60）?±?12.5比12.19?±?4.7條许昨；P?=?0.04）懂盐。此外，與急性排斥反應(yīng)和緩慢或快速移植功能相比糕档，活檢證實的急性腎小管壞死患者的尿鈣異常高甲基化增加（平均值：20.40±6.9莉恼、13.87±6.49、17.17±13.4速那；P=0.67）（16.9±6.2和18.5±13.7俐银；P=0.5）。這些結(jié)果表明端仰，尿DAPK和CALCA基因表觀遺傳學(xué)是一種有前途的急性缺血性損傷生物標(biāo)志物腎移植方法捶惜。在一項針對腎移植患者的研究中，分析了尿液cfDNA荔烧，以了解感染與腎組織損傷之間的關(guān)系吱七。結(jié)果顯示，移植后組織特異性cfDNA尿液絕對濃度由于應(yīng)激損傷而增加鹤竭，但在沒有感染的10天后恢復(fù)到基線踊餐。腎病合并BK病毒感染患者的腎源性cfDNA水平顯著高于正常人和單純BK病毒感染患者（P=4×10-4，P=7.9×10-3）臀稚。此外吝岭，細菌感染患者的膀胱和白細胞cfDNA水平升高（AUC=0.91），表明感染與組織損傷之間可能存在相關(guān)性烁涌。cfDNA片段大小譜可以提供一個指標(biāo)苍碟，通過該指標(biāo)可以對具有不同感染癥狀的患者進行分層。這些發(fā)現(xiàn)表明撮执，分析cfDNA水平可以提高我們對感染相關(guān)腎損傷的理解微峰，并可能導(dǎo)致更好的診斷工具和治療方法。
心臟
基于cfDNA甲基化的檢測已被用于檢測各種情況下的心臟損傷抒钱，包括心臟直視手術(shù)和MI（心肌梗塞）蜓肆。一項新的研究評估了cfDNA分子的六個非甲基化位點作為心臟直視手術(shù)后心臟損傷的標(biāo)志物颜凯。使用六種心肌細胞特異性DNA非甲基化標(biāo)記物檢測42名接受心臟直視手術(shù)的嬰兒血漿中的心臟cfDNA。手術(shù)后心臟cfDNA升高仗扬，反映了與手術(shù)直接相關(guān)的組織損傷症概，大多數(shù)患者術(shù)后cfDNA降低。本研究還使用心臟cfDNA水平來預(yù)測手術(shù)結(jié)果早芭，選擇機械通氣持續(xù)時間（大于或小于24小時）和最大VIS（大于或小于20小時）彼城，并使用ROC（接受者操作特征）曲線作為臨床結(jié)果。作為機械通氣持續(xù)時間或最大VIS的預(yù)測指標(biāo)退个，術(shù)后6小時心臟cfDNA的AUC分別為0.7475和0.7555募壕。類似地，在另一項研究中鑒定出心肌細胞甲基化標(biāo)記物（FAM101A）语盈。ddPCR用于檢測完全未甲基化的FAM101A的血漿cfDNA濃度舱馅，其可以靈敏且特異性地檢測心肌細胞損傷。膿毒癥患者的臨床觀察表明刀荒，心臟cfDNA水平不受腎臟或肝臟損傷的顯著影響代嗤。Jie Ren等人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌損傷發(fā)生時缠借，cfDNA被釋放并鑒定出位于CORO6干毅、CACNA1C（兩個位點）、OBSCN烈炭、CRIP1和ZNF503-AS2的CGI中的六個CGCGCGG位點溶锭，顯示出心臟特異性高甲基化模式。在這些標(biāo)記物中符隙，CORO6在心臟中顯示出最特異性甲基化模式。繼續(xù)研究針對該特定位點的ddPCR測定法的開發(fā)垫毙，該測定法有效地檢測了MI患者入院時cfDNA中心臟損傷的信號霹疫。
肺
基于肺器官特異性cfDNA甲基化檢測已被用于檢測各種情況下的肺損傷，包括慢性阻塞性肺病综芥、肺癌丽蝎、肺結(jié)節(jié)和支氣管檢查后。在2022年的研究中鑒定了17個具有肺特異性甲基化模式位點的甲基化狀態(tài)膀藐，并將其用于評估健康志愿者和肺部疾病患者血漿中肺源性cfDNA屠阻。結(jié)果表明，正常肺上皮的cfDNA甲基化標(biāo)記允許對肺源性cfDNA進行突變獨立额各、靈敏和特異性檢測国觉，從而報告正在進行的肺損傷。Wenhua Liang等人開發(fā)了一種新的非侵入性診斷方法虾啦，該方法基于肺損傷釋放的cfDNA甲基化分析中的9種標(biāo)志物來檢測早期肺癌并將肺癌與良性肺結(jié)節(jié)區(qū)分開麻诀，該模型特異性達到93.2%痕寓。這九個標(biāo)記是cg19864007\U cg22636429\U cg15542994、cg26970841\U cg03978375\U CG2482667蝇闭、cg04175417呻率、cg21962423、cg23156742呻引、cg06287318礼仗、cg21963643、cg07568344和cg12545252逻悠。
腦
在2022年探索側(cè)支組織損傷的液體活檢研究中元践，還鑒定了10個基因組位點，這些位點在神經(jīng)元（cg13131859/cg10030512/cg12560421/cg18519737）蹂风、少突膠質(zhì)細胞（cg26765599/cg20637405/cg25396488）或星形膠質(zhì)細胞（cg22031783/cg01623475/cg01623475）中未甲基化卢厂。來自每種腦細胞類型的信號產(chǎn)生ROC曲線，每種腦細胞類型的標(biāo)志物都能夠識別腦轉(zhuǎn)移患者的血漿惠啄，AUC為0.72-0.81慎恒，神經(jīng)元標(biāo)志物的95%特異性、靈敏度為17.2%撵渡，星形膠質(zhì)細胞標(biāo)志物的95%特異性融柬、靈敏度為13.8%。
胰腺
甲基化組織研究已經(jīng)能夠在器官中定位特定細胞類型趋距，并且可以通過cfDNA甲基化分析檢測細胞損傷粒氧。例如，在血漿胰腺β細胞特異性cfDNA的研究中节腐，發(fā)現(xiàn)70%的β細胞中有六種特異性生物標(biāo)志物（Fbxl19外盯、Mtg1、Leng8翼雀、Zc3h3饱苟、INS、INS反義）完全未甲基化狼渊，其余30%表現(xiàn)出一個或兩個CpG位點甲基化箱熬。該研究發(fā)現(xiàn)胰島移植后胰島β細胞中cfDNA甲基化標(biāo)志物顯著升高，反映了β細胞的損傷和死亡狈邑。此外城须，鑒于β細胞中未甲基化INS-CpG位點頻率增加，細胞死亡后釋放到循環(huán)中的未甲基化與甲基化INS-DNA比例反映了β細胞死亡米苹。一項研究在編碼PRMT1染色質(zhì)靶標(biāo)（CHTOP）的基因內(nèi)鑒定了一個基因內(nèi)CpG位點糕伐，該位點對INS具有互補的組織特異性，可用于增加糖尿病前期和糖尿病青年檢測胰島損傷的信心驱入。兩種未甲基化生物標(biāo)志物組合的特異性高達100%赤炒。
肌肉
肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種進行性神經(jīng)退行性疾病氯析，可導(dǎo)致上運動神經(jīng)元和下運動神經(jīng)元死亡。目前莺褒，尚無確定的ALS循環(huán)生物標(biāo)志物掩缓。因此，很難監(jiān)測疾病進展并有效評估治療反應(yīng)遵岩。cfDNA提供了一個檢測ALS細胞死亡的機會你辣，填補這些空白。在一項研究中尘执，從20名ALS患者和20名對照中分離出血漿cfDNA舍哄，與對照組相比，cfDNA用于鑒定ALS患者RHBDF2基因中的新型差異甲基化標(biāo)記誊锭。該研究進行了ROC分析表悬，以確定RHBDF2基因ALS的診斷效果。其中丧靡，RHBDF2基因具有兩個增強子區(qū)域蟆沫，即CpG1和CpG2。CpG1的AUC為0.724（CI 0.559-0.888温治；P=0.017）饭庞，CpG2的AUC為0.695（CI 0.527-0.863；P=0.038）熬荆。區(qū)分ALS患者和對照組的最佳閾值為CpG1的65.97%（靈敏度=0.850舟山，特異性=0.526）和CpG2的83.26%（靈敏度=0.800，特異性=0.474）卤恳。在現(xiàn)有研究中累盗，針對甲基化cfDNA開發(fā)了一種高校的EM（期望最大化）算法CelFiE（通過期望最大化進行cfDNA分析），其中CelFiE的input是WGBS參考數(shù)據(jù)突琳，允許低覆蓋率和噪聲數(shù)據(jù)幅骄。在該研究中，使用CelFiE從ALS患者和年齡匹配的對照中檢測到cfDNA本今。ALS和對照中cfDNA的總體豐度顯示出顯著差異。ALS組（n=28主巍，平均值=297.2±110.57 pg/ul）和對照組（n=25冠息，平均值=218.78±139.17 pg/ul）。肌萎縮側(cè)索硬化組（ALS組）骨骼肌比例估計值與對照組相比有顯著性差異（P=5.02×10-2）孕索」浼瑁總之，這些結(jié)果表明cfDNA是鑒定肌肉萎縮和死亡的第一個定量生物標(biāo)志物的有希望的方向搞旭，這是ALS的標(biāo)志散怖。
總的來說菇绵，人們對使用基于甲基化檢測方法來檢測器官和組織損傷的跡象越來越感興趣，并且在各種情況下發(fā)現(xiàn)了許多有希望的標(biāo)記物（圖3）镇眷。然而咬最，需要進一步的研究來驗證這些組織特異性甲基化標(biāo)記，并開發(fā)有效的臨床診斷和預(yù)后工具欠动。
從組織器官損傷特異性cfDNA甲基化標(biāo)志物鑒定到臨床檢測路徑
基于甲基化的損傷檢測依賴于組織和器官損傷后DNA甲基化模式變化萤厅。甲基化模式對于每種細胞類型都是特異性的橄抹，在同一個體內(nèi)部和同一細胞類型中保守，并且在生理或病理條件下高度穩(wěn)定祈坠。因此有可能利用與組織和器官損傷相關(guān)的特定cfDNA甲基化模式來鑒定起源組織并推斷組織和器官損傷的程度害碾。鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的特定甲基化標(biāo)記及其在臨床檢測中的應(yīng)用需要多步驟方法。然而赦拘，鑒于新生物標(biāo)志物的不斷發(fā)現(xiàn)和提出慌随，建立一個強大的生物標(biāo)志物驗證和認證系統(tǒng)以確保廣泛接受和正確使用成為當(dāng)務(wù)之急。遵循生物標(biāo)志物認證的各種原則躺同，推斷鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的特定甲基化標(biāo)志物并將其應(yīng)用于臨床檢測過程可能需要幾個不同的階段阁猜，如圖4所示。值得注意的是蹋艺，利用甲基化分析進行組織損傷檢測仍處于早期研究階段剃袍。到目前為止，還沒有進行臨床研究捎谨，也沒有將商業(yè)產(chǎn)品引入臨床環(huán)境民效。
鑒定和驗證潛在的甲基化標(biāo)記
美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）對生物標(biāo)志物的使用設(shè)定了四個類別：預(yù)后性涛救、預(yù)測性畏邢、反應(yīng)指示性和療效反應(yīng)性（表2）。首先检吆，通過進行文獻綜述舒萎，并確定與組織和器官損傷相關(guān)的潛在甲基化標(biāo)志物。這可以通過響應(yīng)損傷的甲基化變化的研究或者已經(jīng)鑒定與健康組織相比患病組織中的DMR（差異甲基化區(qū)域）的研究來完成蹭沛。例如在肝損傷生物標(biāo)志物的研究中臂寝，通過檢查WGBS數(shù)據(jù)并鑒定差異甲基化或差異非甲基化區(qū)域來選擇肝細胞特異性CpG位點章鲤。為了選擇高甲基化標(biāo)記，確定了肝細胞樣品的75th百分位數(shù)和所有非肝細胞樣本的5th百分位數(shù)之間差異超過0.5的區(qū)域咆贬。對于低甲基化標(biāo)記物败徊，需要在95th和20th百分位數(shù)之間有0.5的差異。通過這種方式素征，總共篩選出三種肝細胞標(biāo)志物（cg02396797集嵌、cg030646442、cg21178851）御毅。甲基化DNA數(shù)據(jù)庫是研究與組織損傷相關(guān)的DNA甲基化模式的寶貴資源根欧。這些數(shù)據(jù)庫可用于鑒定生物標(biāo)志物、理解分子機制端蛆、評估嚴(yán)重程度凤粗、監(jiān)測治療反應(yīng)以及研究環(huán)境和生活方式因素。數(shù)據(jù)庫包括參考序列數(shù)據(jù)庫今豆、癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)庫和疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫（表3）嫌拣。這些數(shù)據(jù)庫為有興趣鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的甲基化標(biāo)記的研究人員提供了寶貴的資源。
建立檢測分析
一旦確定了潛在的甲基化標(biāo)記呆躲，就需要開發(fā)一種甲基化檢測方法异逐，可以準(zhǔn)確檢測這些標(biāo)記中的甲基化變化。根據(jù)所分析的特定標(biāo)記插掂，檢測方法可以基于不同的技術(shù)灰瞻，例如MSP（甲基化特異性PCR）、焦磷酸測序（pyrosequencing）辅甥、WGBS（全基因組甲基化測序）或DNA甲基化芯片酝润。設(shè)計分析方法后，需要優(yōu)化檢測參數(shù)璃弄，包括優(yōu)化引物設(shè)計要销、退火溫度（annealing temperature）、循環(huán)條件和檢測方法等檢測參數(shù)夏块，以確保準(zhǔn)確可靠地檢測已鑒定標(biāo)記中的甲基化變化疏咐。
例如Miguel Waterhouse開發(fā)了基于PTK1B和SESN3基因甲基化的ddPCR甲基化測定法，以分析急性移植物抗宿主病患者的組織損傷脐供。同樣Tulsi K.Mehta等人設(shè)計了特異性擴增CALCA基因的引物和探針凳鬓，以開發(fā)一種qPCR（定量PCR）檢測方法，該方法有望用于評估移植環(huán)境中的急性腎損傷患民。在人類急性腎損傷的研究中，通過焦磷酸測序評估了KLK1基因的四個連續(xù)CpG甲基化垦梆，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-203bp至-135bp之間匹颤。在cfDNA甲基化研究中仅孩，Roni-Lehmann-Werman等人建立了ddPCR程序來檢測cfDNA中ITIH4、IGF2R和VTN的甲基化狀態(tài)印蓖，其中甲基化敏感的TaqMan探針用于分析亞硫酸氫鹽處理的cfDNA辽慕。探針的有限長度（最多30 bp）決定了它們只能覆蓋2-4個提供信息的CpG位點。IGF2R位點覆蓋了四個CpG赦肃。VTN位點的探針中只覆蓋兩個CpGs?溅蛉，預(yù)測非肝組織DNA中相對較高的噪聲頻率（陽性液滴）。設(shè)計了兩個TaqMan探針以提高特異性他宛，每個探針都從VTN位點相同擴增的100 bp片段中鑒定出不同嘧啶簇（每個簇包含兩個CpG位點）中的甲基化缺失船侧，并且每個探針都用不同的熒光團標(biāo)記。
分析有效性
分析有效性是驗證檢測方法的一個重要方面厅各，該檢測方法評估所開發(fā)測定的準(zhǔn)確性和可靠性镜撩，包括精確度、靈敏度和特異性队塘。為了確保所開發(fā)的甲基化檢測方法的分析有效性袁梗，應(yīng)采取以下步驟：
精確度評估：使用已知甲基化狀態(tài)的對照樣品，評估檢測方法的精確度憔古。通過分析重復(fù)樣品來計算內(nèi)部精確度和外部精確度遮怜，以確定方法的精確度。
靈敏度評估：使用已知甲基化水平較低或甲基化變化較小的樣品鸿市，評估檢測方法的靈敏度锯梁。評估該方法準(zhǔn)確檢測微小甲基化變化的能力。
特異性評估：使用具有不同甲基化模式或來自不同來源的樣品灸芳，評估檢測方法的特異性涝桅。確定該方法準(zhǔn)確檢測甲基化變化而無假陽性的能力。
使用具有已知甲基化狀態(tài)的對照樣品驗證開發(fā)的測定法有助于建立檢測方法的準(zhǔn)確性和靈敏度烙样。這有助于評估該方法在甲基化檢測中的性能冯遂，并為其臨床應(yīng)用提供可靠的基礎(chǔ)。
臨床有效性
在建立分析有效性后谒获，會啟動臨床研究以建立臨床有效性：證明生物標(biāo)志物和檢測方法適合特定使用背景的目的蛤肌，即分析結(jié)果將為醫(yī)療決策提供信息。應(yīng)使用臨床樣品評估所開發(fā)檢測方法的臨床有效性批狱，例如從具有特定組織或器官損傷的患者獲得的血液或組織樣品裸准。該驗證過程旨在確定該測定是否可以有效區(qū)分有損傷和無損傷患者，并評估損傷個體的臨床靈敏度赔硫、臨床特異性和檢出率炒俱。臨床靈敏度是指測定正確鑒定具有特定組織或器官損傷的個體的能力，而臨床特異性是指測定正確識別沒有損傷的個體的能力。應(yīng)評估該測定的靈敏度和特異性权悟，以確定其在臨床環(huán)境中的準(zhǔn)確性砸王。此外，應(yīng)評估受傷個體的檢出率峦阁，這反映了臨床診斷為受傷的患者中陽性結(jié)果的比例谦铃。這些信息可以幫助評估檢測方法在檢測預(yù)期患者群體中特定組織或器官損傷方面的性能。
例如榔昔，基于PTK1B基因的ddPCR甲基化檢測方法在28名急性移植物抗宿主簿匀颉（aGvHD）患者和11名無相關(guān)癥狀的患者中進行了臨床驗證，區(qū)分肝臟aGvHD與非aGvHD的最佳閾值為1.5（logPTK2拷貝/mL血漿撒会；靈敏度：0.928嘹朗；特異性：0.910）。同樣茧彤，Asel Lubotzky等人招募了65名健康供體骡显、85名局部癌癥（非肝臟）患者、55名非肝臟轉(zhuǎn)移性癌癥患者和63名有肝臟轉(zhuǎn)移的癌癥患者曾掂，以驗證基于cfDNA PCR測序分析的檢測方法在區(qū)分肝臟轉(zhuǎn)移方面的表現(xiàn)惫谤。結(jié)果表明，通過這種方法檢測到的肝細胞的AUC濃度為0.81（95%置信區(qū)間=0.74–0.87珠洗，P= 0.0001）溜歪。肝臟轉(zhuǎn)移檢測的特異性和靈敏度分別為95%和35%。
臨床效用
臨床效用是指在考慮PPV（陽性預(yù)測值）许蓖、NVP（陰性預(yù)測值）和成本等因素下蝴猪，評估患者檢測中開發(fā)的檢測方法的成本效益。臨床效用的評估可以考慮多種因素膊爪，包括但不限于以下因素自阱。
診斷準(zhǔn)確性：評估甲基化檢測方法在正確鑒定患者組織或器官損傷方面的靈敏度、特異性米酬、PPV和NPV沛豌。臨床影響：評估甲基化檢測方法對治療決策和患者管理的影響，例如它是否有助于選擇適當(dāng)?shù)闹委熯x項赃额、監(jiān)測治療反應(yīng)或預(yù)測疾病復(fù)發(fā)加派。
成本效益：考慮與甲基化檢測過程相關(guān)的成本，包括樣本收集跳芳、實驗室檢測芍锦、數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解釋，并將其與潛在的益處進行權(quán)衡飞盆，如改善患者結(jié)果娄琉、降低醫(yī)療保健成本和提高患者滿意度次乓。
可行性和可擴展性：評估在臨床環(huán)境中實施甲基化檢測方法的實際可行性，包括樣本收集的便利性车胡、所需的實驗室基礎(chǔ)設(shè)施和專業(yè)知識檬输，以及擴展到更大患者人群的可擴展性。
比較效果：在準(zhǔn)確性匈棘、臨床影響和成本效益方面，將甲基化檢測方法與現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法或替代方法進行比較析命。
倫理和法律考慮：在評估臨床效用時主卫，考慮倫理和法律考慮因素，如患者隱私鹃愤、知情同意和遵守監(jiān)管要求簇搅。
總之，鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的特定甲基化標(biāo)記物软吐，并將其應(yīng)用于臨床檢測瘩将，需要一種嚴(yán)格和系統(tǒng)的方法，涉及多個研究凹耙、驗證和檢測階段姿现。然而，值得注意的是肖抱，目前使用甲基化分析進行組織損傷檢測仍處于研究的早期階段备典，迄今為止，尚未進行臨床研究意述，也未在臨床環(huán)境中實施任何商業(yè)產(chǎn)品提佣。
研究人員、臨床醫(yī)生和行業(yè)伙伴之間的合作對于確被绯纾基于甲基化的診斷檢測方法的成功開發(fā)和臨床應(yīng)用非常必要拌屏。
挑戰(zhàn)和未來方向
結(jié)合之前的討論，研究甲基化標(biāo)記物在組織和器官損傷中的應(yīng)用存在一些挑戰(zhàn)术荤。挑戰(zhàn)和未來的研究方向包括：
個體之間甲基化模式的變異性
根據(jù)之前的大量研究倚喂，DNA甲基化模式在個體之間差異很大，并且與性別喜每、生活環(huán)境和許多其他因素有關(guān)务唐。因此，在臨床上使用DNA甲基化分析來檢測組織損傷仍然存在許多困難带兜。這一挑戰(zhàn)的一個潛在解決方案是使用大規(guī)模研究來確定跨人群一致的甲基化模式枫笛，而不是依賴于單個標(biāo)記。這種方法可以幫助鑒定不同個體之間常見的甲基化模式刚照，并且可以用作鑒定與不同組織或器官相關(guān)的甲基化變化的參考刑巧。通過鑒定這些常見模式，研究人員可以減少個體變異性的影響，提高甲基化分析的準(zhǔn)確性啊楚。另一種方法包括利用機器學(xué)習(xí)算法來辨別特定類型組織損傷所特有的甲基化模式吠冤。這種方法不再僅僅依賴于可能受個體變異性影響的個體標(biāo)記，而是側(cè)重于能夠提供更穩(wěn)健和可靠見解的綜合模式恭理。這種方法可以幫助鑒定與特定類型的組織損傷或疾病相關(guān)的甲基化變化拯辙。通過關(guān)注特定的甲基化模式，研究人員可以減少個體變異性的影響颜价，提高甲基化分析的準(zhǔn)確性涯保。
外部因素對甲基化模式的影響
由于外部因素對DNA甲基化模式的影響，這種影響可能會干擾組織和器官損傷篩查周伦，診斷和治療的決策夕春。未來的研究可以集中在鑒定和調(diào)控可能影響甲基化模式的外部因素，如生活方式因素和環(huán)境暴露专挪〖爸荆可以通過收集有關(guān)這些因素的詳細信息的大規(guī)模人群研究以及使用動物模型研究特定暴露對甲基化模式影響的實驗研究來完成。例如寨腔，當(dāng)Kang Li研究HBV與相關(guān)慢性肝炎之間的關(guān)系以及外周免疫系統(tǒng)的甲基化時速侈，發(fā)現(xiàn)外周免疫系統(tǒng)的甲基化模式受到外部因素的影響。因此脆侮，他們將Bonferroni校正應(yīng)用于代償性肝硬化預(yù)測模型構(gòu)建中的潛在混雜因素锌畸，并發(fā)現(xiàn)了真正顯著的相關(guān)性。
檢測方法的技術(shù)局限性和不一致性
現(xiàn)有的甲基化檢測方法也存在技術(shù)缺陷靖避，例如靈敏度和特異性問題潭枣。該領(lǐng)域的研究可以集中于開發(fā)更靈敏和更具體的檢測甲基化變化的方法。這可能包括使用納米孔測序和單細胞測序等新技術(shù)幻捏，以及開發(fā)用于分析甲基化數(shù)據(jù)的改進生物信息學(xué)工具盆犁。此外，研究可以集中于鑒定和解決現(xiàn)有甲基化檢測方法的技術(shù)局限性篡九。例如谐岁，亞硫酸鹽測序是檢測DNA甲基化最常用的方法，由于亞硫酸鹽處理過程中未甲基化C和DNA損傷的不完全轉(zhuǎn)化榛臼，可能會產(chǎn)生偏差和不準(zhǔn)確伊佃。解決這些問題的新方法，例如使用替代化學(xué)處理或改進的酶轉(zhuǎn)化方法沛善，可以提高甲基化檢測的準(zhǔn)確性和可靠性航揉。此外，研究可以調(diào)查技術(shù)因素對甲基化分析的影響金刁，例如DNA質(zhì)量和數(shù)量帅涂，測序深度和文庫制備方法议薪。鑒定和減輕這些因素可以幫助減少變異并提高甲基化研究的可重復(fù)性。
結(jié)論與展望
甲基化檢測方法在各種情況下表現(xiàn)出檢測器官和組織損傷方面的巨大潛力媳友。這些檢測有望檢測早期損傷斯议、監(jiān)測組織和器官損傷的進展，評估治療效果和預(yù)測移植結(jié)果醇锚。然而哼御，仍有一些挑戰(zhàn)需要克服，包括甲基化模式的變異性焊唬，可能影響甲基化模式的外部因素以及檢測方法的技術(shù)局限性艇搀。盡管存在這些挑戰(zhàn)，但人們對這一領(lǐng)域產(chǎn)生了濃厚的興趣求晶，正在進行的研究繼續(xù)確定有前途的標(biāo)記物派撕，并開發(fā)有效的診斷和監(jiān)測工具誓军。隨著技術(shù)的不斷進步和DNA甲基化模式的更好理解，基于甲基化的檢測有可能通過分析血液或其他體液來顯著改善臨床環(huán)境中器官和組織損傷的診斷和管理抡柿，這將顯著改善患者獲得診斷測試和監(jiān)測辟宗。使用基于DNA甲基化的檢測來預(yù)測對不同治療的反應(yīng)爵赵，可以為器官和組織損傷提供個性化醫(yī)療方法。研究表觀遺傳變化（包括DNA甲基化）在器官和組織損傷的發(fā)展和進展中的作用泊脐，也將為疾病機制和潛在的新治療靶點提供見解空幻。
參考文獻：ZhangL, Li J. Unlocking the secrets: the power of methylation-based cfDNA detectionof tissue damage in organ systems. Clin Epigenetics. 2023 Oct 19;15(1):168.pii: 10.1186/s13148-023-01585-8. doi: 10.1186/s13148-023-01585-8. PubMed PMID:37858233.
