1. DNA甲基化
1.1 基本概念
DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式，能在不改變DNA序列的前提下,改變遺傳表現(xiàn)。為外遺傳編碼(epigenetic code)的一部分,是一種外遺傳機(jī)制。它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl-transferase, DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作為甲基供體粗仓，將DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基空民，主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)(常見于基因的5'-CG-3'序列)和少量的N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鳥嘌呤(7-mG)結(jié)構(gòu)±疑耄基因含有很多CpG 結(jié)構(gòu)减宣，2CpG 和2GPC 中兩個(gè)胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化，且兩個(gè)甲基集團(tuán)在DNA 雙鏈大溝中呈特定三維結(jié)構(gòu)玩荠。DNA甲基化可能使基因沉默化,進(jìn)而使其失去功能漆腌。而且，生物體甲基化的方式是穩(wěn)定的阶冈，可遺傳的闷尿。此外,也有一些生物體內(nèi)不存在DNA甲基化作用。
DNA甲基化的主要形式：
5-甲基胞嘧啶（5-mC）：最重要的一種DNA甲基化修飾女坑，廣泛存在于植物填具、動(dòng)物等真核生物基因組中, 稱譽(yù)為“第五堿基”。
5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）：哺乳動(dòng)物的“第六堿基”匆骗。
N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）：在細(xì)菌灌旧、藻類及動(dòng)植物基因組中存在绑咱。
7-甲基鳥嘌呤（7-mG）
DNA甲基化作為生物標(biāo)志物的潛力：
相比基因組，DNA甲基化能夠反應(yīng)環(huán)境的影響
DNA甲基化不像基因組那么一成不變枢泰，也不像轉(zhuǎn)錄組和蛋白組那么不穩(wěn)定描融。
DNA甲基化處于動(dòng)態(tài)變化中，能夠像年輪一樣記錄環(huán)境因素的影響衡蚂。
DNA甲基化標(biāo)志物是最有應(yīng)用前景的表觀遺傳標(biāo)志物窿克。
1.2 CpG島
某些區(qū)域CpG序列的密度比平均密度高10~20倍,GC含量大于50%,長度大于200bp的區(qū)域,稱為CpG島。正常細(xì)胞中,CpG二核苷酸在人類基因組中占10%,包括散CpG和CpG 島毛甲。其中,70-90%的散在CpG呈高甲基化狀態(tài),而大部分CpG 島中的CpG呈低甲基化狀態(tài)（未甲基化的CpG成簇地組成CpG島）年叮。CpG島主要位于結(jié)構(gòu)基因的啟子和第一外顯子區(qū)域（結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)）,約有60%以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島。人類基因組序列草圖分析結(jié)果表明,人類基因組CpG島約為28890個(gè),大部分染色體每1Mb就有5-15個(gè)CpG島,平均值為每Mb含10.5個(gè)CpG島,CpG島的數(shù)目與基因密度有良好的對應(yīng)關(guān)系玻募。CpG島通過甲基化與去甲基化,從而調(diào)控下游基因的表達(dá)只损。DNA 甲基化可引起基因組中相應(yīng)區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，使DNA 失去核酶?限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)七咧，以及DNA 酶的敏感位點(diǎn)跃惫，使染色質(zhì)高度螺旋化，凝縮成團(tuán)艾栋，失去轉(zhuǎn)錄活性爆存。5位C甲基化的胞嘧啶脫氨基生成胸腺嘧啶，由此可能導(dǎo)致基因置換突變蝗砾，發(fā)生堿基錯(cuò)配:T2G先较，如果在細(xì)胞分裂過程中不被糾正，就會(huì)誘發(fā)遺傳病或癌癥悼粮。
2. DNA甲基化的主要功能
DNA甲基化能引起染色體結(jié)構(gòu)闲勺、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式改變扣猫，從而控制基因的表達(dá)菜循。
- 保持基因組遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性 研究證明,細(xì)菌DNA復(fù)制起始與DNA甲基化及DNA與細(xì)菌質(zhì)膜的相互作用有關(guān),DNA甲基化作為一種標(biāo)簽決定了復(fù)制起始點(diǎn),控制了復(fù)制起始,使得DNA復(fù)制與細(xì)胞分裂保持一致;DNA錯(cuò)配修復(fù)是細(xì)胞增殖過程中糾正DNA復(fù)制錯(cuò)誤的重要手段。復(fù)制后雙鏈DNA在短期內(nèi)(數(shù)分鐘)保持半甲基化狀態(tài),錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)從而能夠區(qū)分舊鏈與新鏈,為新鏈中摻入的錯(cuò)誤堿基提供了分子標(biāo)記苞笨。
- 調(diào)控基因的表達(dá) DNA甲基化為非編碼區(qū)(如內(nèi)含子等)的長期沉默提供了一種有效的抑制機(jī)制债朵。基因啟動(dòng)區(qū)域內(nèi)CpG位點(diǎn)的甲基化通過三種方式影響基因轉(zhuǎn)錄活性:DNA序列甲基化直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合;甲基CpG結(jié)合蛋白結(jié)合到甲基化CpG位點(diǎn)與其他轉(zhuǎn)錄抑制因子相互作用;染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的凝集阻礙了轉(zhuǎn)錄因子與其調(diào)控序列的結(jié)合瀑凝。）
- DNA甲基化與胚胎發(fā)育 在胚胎發(fā)育的過程中,基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化水平會(huì)發(fā)生劇烈的改變,其中,改變尤為劇烈的是配子形成期與早期胚胎發(fā)育階段序芦。錯(cuò)誤甲基化模式的建立可能會(huì)引起人類疾病,如脆性X染色體綜合征。
- DNA甲基化與腫瘤發(fā)生 腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態(tài)的改變,其特點(diǎn)是總體甲基化水平的降低與局部甲基化水平的升高粤咪。在腫瘤細(xì)胞中,癌基因處于低甲基化狀態(tài)而被激活,抑癌基因處于高甲基化狀態(tài)而被抑制谚中。
3. 甲基化測序
甲基化測序中的核心化學(xué)反應(yīng)，是用亞硫酸氫鹽處理DNA。在弱酸性條件下宪塔，亞硫酸氫根會(huì)結(jié)合到?jīng)]有甲基化的C堿基的6位磁奖，而甲基化了的C堿基不會(huì)發(fā)生這個(gè)反應(yīng)。然后用堿來處理某筐，結(jié)合了亞硫酸氫根的非甲基化的C就會(huì)被脫氨基比搭，并且脫亞硫酸根并轉(zhuǎn)化成U堿基。甲基化或羥甲基化了的C堿基保持不變南誊。
亞硫酸鹽處理可以讓99%左右的非甲基化C堿基變成U身诺。
接著通過高通量測序的方法，可以精確地看到單個(gè)堿基的甲基化水平抄囚。經(jīng)過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過的DNA霉赡，經(jīng)過PCR，PCR新和成的鏈幔托，U堿基的位置就被替換成了T堿基穴亏。在接下來的測序過程中，測到的也是T堿基重挑。而甲基化的C沒有被轉(zhuǎn)化嗓化，在接下來的測序過程中還是C堿基。這樣通過測序即可根據(jù)單個(gè) C 位點(diǎn)上未轉(zhuǎn)化為 C 未轉(zhuǎn)化為 T 的 reads 數(shù)目與所有覆蓋的 reads 數(shù)目的比例攒驰，計(jì)算得到甲基化率蟆湖。
4. cfDNA甲基化測序
DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾機(jī)制故爵，在細(xì)胞生長玻粪、分化和疾病發(fā)展等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。不同組織和器官有其獨(dú)特的DNA甲基化特征诬垂，當(dāng)組織或器官受損時(shí)劲室，凋亡細(xì)胞釋放cfDNA入血，而cfDNA會(huì)維持原本的組織器官甲基化特征结窘。隨著多種器官組織甲基化圖譜的公開很洋，可以根據(jù)cfDNA甲基化模式結(jié)合反卷積算法確定cfDNA的組織來源。cfDNA甲基化分析可能成為組織損傷檢測的一種極有前景的無創(chuàng)診斷方法隧枫。
