劉小澤寫(xiě)于19.4.3-4
果然是大文章，內(nèi)容比較豐富用爪。
熱烈慶祝sci-hub合法化漏策，這下大家可以自由自在使用了
之前的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究中，許多實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的腫瘤微環(huán)境分辨率不足只估，或者忽視了腫瘤與對(duì)應(yīng)的正常樣品的比較志群。并且許多單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析算法則受到高背景噪音、批次效應(yīng)蛔钙、技術(shù)誤差的干擾（原因主要是臨床樣本采集的條件锌云、批次不同），限制了分析的準(zhǔn)確性吁脱。
2017年美國(guó)Jaxon實(shí)驗(yàn)室桑涎、新加坡基因組研究所和新加坡國(guó)家癌癥研究中心共同發(fā)表在Nature genetics的題為Reference component analysis of single-cell transcriptomes elucidates cellular heterogeneity in human colorectal tumors 。主要開(kāi)發(fā)了一種叫做RCA(reference component analysis)即參考成分分析的新型算法兼贡，相比舊算法可以顯著提高聚類(lèi)準(zhǔn)確性攻冷，對(duì)細(xì)胞類(lèi)型、腫瘤微環(huán)境的識(shí)別率提高遍希。利用這個(gè)方法讲衫，發(fā)現(xiàn)了兩種獨(dú)特的成纖維細(xì)胞（CAFs）亞型，其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因顯著上調(diào)表達(dá)孵班；將結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞依據(jù)不同的細(xì)胞狀態(tài)和生存概率分成不同的亞型，更準(zhǔn)確的細(xì)胞分類(lèi)對(duì)預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義招驴。
背景知識(shí)
腫瘤異質(zhì)性
腫瘤異質(zhì)性包括腫瘤間異質(zhì)性（不同腫瘤細(xì)胞之間的基因與表型不同）和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（相同腫瘤細(xì)胞以?xún)?nèi)的基因與表型也不同）篙程，其中腫瘤內(nèi)異質(zhì)性又粗略分為空間異質(zhì)性（未擴(kuò)增的細(xì)胞背景中有成簇?cái)U(kuò)增細(xì)胞；少量擴(kuò)增背景中有未擴(kuò)增的細(xì)胞别厘；孤立的細(xì)胞擴(kuò)增）與時(shí)間異質(zhì)性（原初腫瘤與次生腫瘤）虱饿。
Nature一篇文章按照其來(lái)源分為患者異質(zhì)性 (patient hetero-geneity) 和瘤內(nèi)異質(zhì)性 (intratumoral heterogeneity)，其中患者異質(zhì)性就是指同種類(lèi)型腫瘤在不同患者中表現(xiàn)出差異触趴，瘤內(nèi)異質(zhì)性指同一患者的同一部位腫瘤內(nèi)存在的明顯差異氮发。
瘤內(nèi)異質(zhì)性一直是研究重點(diǎn)，異質(zhì)性是產(chǎn)生抗藥性的主要原因冗懦，而異質(zhì)性產(chǎn)生的主要原因又與腫瘤干細(xì)胞的發(fā)生爽冕、遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定、細(xì)胞間競(jìng)爭(zhēng)等相關(guān)披蕉。
腫瘤干細(xì)胞：是指腫瘤中存在的一小群具有無(wú)限自我更新能力的干細(xì)胞樣細(xì)胞,可以演化成表型不同的細(xì)胞群,具有強(qiáng)致瘤性颈畸。受細(xì)胞分化乌奇、克隆演化和微環(huán)境等因素影響,導(dǎo)致表型與功能的異質(zhì)性。這也是現(xiàn)在關(guān)于異質(zhì)性來(lái)源最為普遍的的觀點(diǎn)
遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定：腫瘤細(xì)胞是異倍體眯娱，一篇2013年Nature在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)3個(gè)與DNA復(fù)制相關(guān)的基因MCD4礁苗、MEX3C和ZNF516，基因的缺失導(dǎo)致DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)應(yīng)激=》異倍體出現(xiàn)=》異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)
上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
EMT（epithelial-mesenchymal transition）是Greenberg和Hay于1982年提出的徙缴，指的是可逆的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞 (2014 Trends Pharmacol Sci)的生物學(xué)過(guò)程试伙。上皮細(xì)胞將經(jīng)歷持續(xù)的細(xì)胞活動(dòng), 包括失去頂-底極性結(jié)構(gòu), 細(xì)胞間連接受到破壞, 細(xì)胞骨架重構(gòu), 改變細(xì)胞形態(tài)并最終呈現(xiàn)出間質(zhì)及侵襲表型, 從而增加細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性并提高其降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力（2009 Cell）。
惡性腫瘤中絕大多數(shù)是上皮性腫瘤于样，發(fā)生EMT的惡性腫瘤細(xì)胞將獲得增強(qiáng)的遷移及侵襲能力并侵入周?chē)募?xì)胞外基質(zhì), 最終向遠(yuǎn)處位點(diǎn)轉(zhuǎn)移疏叨，在結(jié)腸癌、甲狀腺癌及乳腺癌的侵襲表型中發(fā)揮重要作用百宇。發(fā)生EMT的細(xì)胞具有抵抗細(xì)胞凋亡考廉、衰老、化療和免疫治療的能力, EMT通過(guò)誘導(dǎo)免疫耐受使惡性腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視携御。也有研究表明EMT與腫瘤干細(xì)胞的特性相關(guān)(2016昌粤，Sci Report；2016啄刹，Sci Report涮坐；2015，Cancer Letter)
方法
樣本選擇
選擇11例 II-IV期結(jié)直腸癌樣本誓军，由新加坡總醫(yī)院的新加坡國(guó)立癌癥中心提供袱讹。原發(fā)腫瘤手術(shù)切除后，置于無(wú)菌昵时、低溫的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)捷雕。
選出單個(gè)細(xì)胞
分離得到的單個(gè)細(xì)胞生活力由Calcein-AM and Ethidium Homodimer 1 (Live/Dead Kit, Life Technologies) 評(píng)估，然后加到 RNA–seq IFC-C1芯片上進(jìn)行細(xì)胞捕獲壹甥，然后基于 bright-field and Calcein-AM imaging進(jìn)行芯片成像救巷，只有真正單個(gè)的細(xì)胞可以繼續(xù)進(jìn)行文庫(kù)制備和測(cè)序。
文庫(kù)制備和測(cè)序
根據(jù)cDNA濃度和質(zhì)量丟棄低質(zhì)量的單細(xì)胞后句柠，利用Illumina 的Nextera XT DNA樣本制備試劑盒進(jìn)行單獨(dú)的文庫(kù)制備浦译，然后采用Hiseq2000平臺(tái)101bp PE方案對(duì)總共1591個(gè)CRC分離的腫瘤細(xì)胞和正常組織配對(duì)細(xì)胞，以及7個(gè)細(xì)胞系的630個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序溯职。
測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理
原始fq數(shù)據(jù)利用Tophat 2.1.0比對(duì)到hg19基因組精盅，利用的是GENCODEv19注釋文件(Tophat參數(shù)：--read-edit-dist設(shè)置為3，--read-realign-edit-dist設(shè)置為0)谜酒。max-multihits參數(shù)設(shè)為1叹俏，保證BAM文件中只有一個(gè)uniquely mapped reads。表達(dá)定量使用Cuffdiff-2.2.1甚带，設(shè)置參數(shù)--frag-bias-correct 以及--library-norm-method 選擇FPKM標(biāo)準(zhǔn)化她肯。為了減少rRNAs, tRNAs以及小RNA（snRNAs and snoRNAs ）對(duì)FPKM的影響佳头，需要利用Cuffdiff的--mask-file參數(shù)，最后導(dǎo)出原始的reads count矩陣晴氨。
質(zhì)控過(guò)濾
計(jì)算幾個(gè)統(tǒng)計(jì)值：
- FASTQR： the number of paired-end sequences in the FASTQ file
- BAMMR（Mapped reads in BAM）：the number of uniquely mapped reads in the aligned BAM file
- ER（Exonic reads ）：summing raw read counts across all genes
- ROER (rate of exonic reads)：the ratio between ER and BAMMR
- NODG(number of detected genes)： total number of genes with FPKM ≥1
加入幾個(gè)看家基因作為參考：TFRC, ACTB,RPLP0, PGK1, GAPDH, LDHA, NONO, B2M, GUSB and PPIH
選擇NODG>1000, ROER>5%, ER>0.1M的細(xì)胞康嘉，總共626個(gè)CRC細(xì)胞與正常組織配對(duì)細(xì)胞，561個(gè)來(lái)自細(xì)胞系的細(xì)胞籽前。
The number of detected genes (NODG) 與the rate of exonic reads (ROER) 比值亭珍。 顏色表示看家基因表達(dá)量的log10 (FPKM).
對(duì)細(xì)胞系scRNA-seq數(shù)據(jù)集的聚類(lèi)方法評(píng)估
使用7種細(xì)胞系的原始630個(gè)細(xì)胞(其中561個(gè)通過(guò)了質(zhì)控過(guò)濾)；為了評(píng)估批次效應(yīng)的處理枝哄，其中包含了兩個(gè)批次： GM12878 (lymphoblastoid) cells 和 H1 embryonic stem cells肄梨。
八種方法：All-HC、HiLoadG-HC挠锥、BackSPIN众羡、RaceID2、Seurat蓖租、VarG-HC粱侣、VarG-PCAprojHC、VarG-tSNEproj-HC
- All-HC：選擇FPKM大于等于0.001且至少存在于2個(gè)細(xì)胞中的基因蓖宦，用log10(FPKM)值來(lái)聚類(lèi)齐婴，使用
‘a(chǎn)verage’-linkage neighbor joining算法 - HiLoadG-HC：選擇PC1、PC2稠茂、或PC3的排名前100或后100基因柠偶，利用log10(FPKM)值進(jìn)行層次聚類(lèi)，使用
average linkage算法 -
BackSPIN：使用參數(shù)
-f 2000 -v -d 4對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)睬关，這樣會(huì)比默認(rèn)參數(shù)得到更精確地類(lèi)群劃分 - RaceID2：使用默認(rèn)參數(shù)對(duì)原始FPKM進(jìn)行聚類(lèi)诱担，不需要對(duì)數(shù)據(jù)取log值降低維度(改變默認(rèn)參數(shù)結(jié)果沒(méi)有明顯改進(jìn))，使用
within-cluster-dispersion算法电爹，聚類(lèi)數(shù)k=7 -
Seurat：使用
RegreeeOut函數(shù)的latent.vars參數(shù)設(shè)定為nUMI该肴，使用model.use參數(shù)設(shè)定為linear(當(dāng)model.use = negbinom是結(jié)果相似) - VarG-HC：使用BackSPIN挑選基因的方法，選出前1000變化最大的基因藐不，然后進(jìn)行層次聚類(lèi)，表達(dá)量值也是取log10以后的
- VarG-PCAproj-HC：方法與VarG-HC相同秦效，只是選擇基因后利用PCA進(jìn)行降維雏蛮，保留表達(dá)矩陣中90%的方差
- VarG-tSNEproj-HC：方法VarG-HC相同，只是后來(lái)使用t-SNE降維
評(píng)級(jí)聚類(lèi)準(zhǔn)確度的指標(biāo)為ARI(adjusted Rand index)阱州，0-1之前挑秉，數(shù)值越大表示聚類(lèi)效果越好
利用黑色素瘤的scRNA數(shù)據(jù)集對(duì)算法評(píng)估
數(shù)據(jù)集在GSE72056，其中有4645個(gè)黑色素瘤細(xì)胞的表達(dá)數(shù)據(jù)苔货，主要研究6種細(xì)胞類(lèi)型以及根據(jù)marker基因過(guò)濾得到的細(xì)胞：T細(xì)胞(CD2, CD3D, CD3E, CD3G)犀概，B cells (CD19,CD79A, CD79B, BLK), macrophages (CD163, CD14, CSF1R), endothelial cells (PECAM1, VWF, CDH5), CAFs (FAP, THY1, DCN, COL1A1, COL1A2,
COL6A1, COL6A2, COL6A3) and malignant melanoma cells (MIA, TYR,
SLC45A2)立哑。排除了沒(méi)有檢測(cè)到任何marker的細(xì)胞，其余細(xì)胞在marker表達(dá)量的基礎(chǔ)上進(jìn)行層次聚類(lèi)姻灶，最后將4057個(gè)細(xì)胞劃分成了6類(lèi)
結(jié)果
RCA比現(xiàn)有的聚類(lèi)算法表現(xiàn)更優(yōu)
顏色代表7種不同細(xì)胞系铛绰，形狀表示H1 and GM12878數(shù)據(jù)的批次；上面是聚類(lèi)樹(shù)产喉，下面是PCA(RaceID2和Seurat使用的是tSNE)
- 盡管All-HC可以將大多數(shù)細(xì)胞準(zhǔn)確地分開(kāi)捂掰，但還有約15%的細(xì)胞聚類(lèi)不正確(ARI=0.66)，另外曾沈，H1和 GM12878 都按批次被分開(kāi)这嚣，也就是說(shuō)同一批次沒(méi)被放在一起；
- HiLoadG-HC的效果不好(ARI=0.53)塞俱，有大量細(xì)胞沒(méi)有正確聚類(lèi)姐帚，然后也是H1和 GM12878 都按批次被分開(kāi)；
- BackSPIN的ARI結(jié)果和All-HC相似障涯；
- RaceID2的準(zhǔn)確度要低許多(ARI=0.15)罐旗，受批次效應(yīng)影響更大；
- Seurat相對(duì)于All-HC有一些改善(ARI=0.70)像樊，但是也存在批次影響尤莺，大量細(xì)胞分類(lèi)錯(cuò)誤；
- 另外三種VarG方法(圖片在附件中)的ARI從0.0005-0.13生棍，效果比較差颤霎；
- RCA得到了緊密的細(xì)胞群，而且?guī)缀醵加上嗤?lèi)型細(xì)胞組成涂滴，另外即使在不同批次中的相同類(lèi)型細(xì)胞也會(huì)聚在一起(ARI=0.91)
另外利用以上算法分析了黑色素瘤的scRNA數(shù)據(jù)友酱，結(jié)果也是RCA具有近乎完美的準(zhǔn)確性，ARI遠(yuǎn)超其他算法
利用RCA鑒定了CRC腫瘤細(xì)胞多種細(xì)胞類(lèi)型
分析了11個(gè)CRC患者的969個(gè)細(xì)胞以及作為對(duì)照的7個(gè)患者正常組織的622個(gè)粘膜細(xì)胞柔纵。嚴(yán)格過(guò)濾得到375個(gè)腫瘤細(xì)胞和215個(gè)正常粘膜細(xì)胞
左圖是RCA對(duì)正常粘膜細(xì)胞聚類(lèi)缔杉；右圖是對(duì)CRC腫瘤細(xì)胞聚類(lèi)
其中聚類(lèi)圖表示細(xì)胞類(lèi)型聚類(lèi)；上面的熱圖中搁料，列表示細(xì)胞或详，行表示RCA中的reference panel，顏色表示數(shù)據(jù)投射到reference panel 的分值郭计；
中間的熱圖表示原始log10(FPKM)在各個(gè)marker中的表達(dá)量霸琴；
最下面的熱圖中行為不同的患者，每行的黑色小塊表示該患者的細(xì)胞
利用RCA global panel模式一共得到CRC與正常細(xì)胞的7種細(xì)胞類(lèi)型：上皮細(xì)胞（ epithelial cells）昭伸、纖維原細(xì)胞（fibroblasts）梧乘、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells,）、B細(xì)胞、T細(xì)胞选调、肥大細(xì)胞（mast cells）和髓系細(xì)胞(myeloid cells )夹供。其中上皮細(xì)胞并沒(méi)有繼續(xù)分亞群(比如enterocytes, goblet cells and transit-amplifying (TA) cells)。
為了測(cè)試是否為RCA算法導(dǎo)致仁堪，又使用了RCA的self-projection模式哮洽，選擇了上皮單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為reference panel，結(jié)果正常的上皮細(xì)胞分成9種亞型枝笨，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)批次效應(yīng)袁铐，并且分出的亞型和上皮細(xì)胞的marker也是可以對(duì)應(yīng)上的，說(shuō)明了確實(shí)可以得到不同的細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞狀態(tài)横浑。
關(guān)于這兩種RCA的模式的具體算法 剔桨，可以在文中methods出查到
對(duì)腫瘤上皮細(xì)胞進(jìn)行分群，結(jié)果得到三個(gè)亞群： stem/TA-like, enterocyte 2B–like and goblet-like徙融。其中 stem/TA-like占到93%洒缀，而之前正常粘膜上皮細(xì)胞中只有30%，這也與CRC細(xì)胞的增殖特性一致欺冀。
因此树绩，即使臨床樣本存在批次效應(yīng)，但是正常粘膜與CRC細(xì)胞中依然可以較為準(zhǔn)確地識(shí)別細(xì)胞類(lèi)型隐轩。
揭示CRC腫瘤差異表達(dá)基因
先進(jìn)行一個(gè)假設(shè)：scRNA與bulk RNA對(duì)腫瘤-正常組織得到的差異基因存在顯著差異饺饭。對(duì)scRNA的結(jié)果分析：從腫瘤樣本中選擇了5個(gè)最大的細(xì)胞群( stem/
TA-like epithelial cells, fibroblasts, B cells, T cells and myeloid cells)，每個(gè)細(xì)胞群與正常粘膜細(xì)胞群比對(duì)职车，共得到129個(gè)差異基因(FDR<0.05)瘫俊。其中 stem/TA-like cells 和fibroblasts的差異基因數(shù)量最多。所有的差異基因放在了：https://media.nature.com/original/nature-assets/ng/journal/v49/n5/extref/ng.3818-S1.pdf 的 Supplementary Note中悴灵，并且有許多在之前的CRC功能研究中被報(bào)道扛芽。總體來(lái)說(shuō)积瞒，大部分在scRNA中檢測(cè)的差異基因在bulk RNA中沒(méi)有檢測(cè)到川尖，從另一個(gè)方面展示了scRNA的優(yōu)越性
a-d分別是 stem/TA cells and tumor stem/TA-like cells 、normal fibroblasts and tumor fibroblasts 茫孔、normal and tumor myeloid cells叮喳、normal and tumor B cells的 bulk RNA和scRNA差異基因
綠色是bulkRNA檢測(cè)的DEGs，灰色是bulkRNA檢測(cè)的non-DEGs缰贝，紅三角是scRNA檢測(cè)的上調(diào)DEGs嘲更，藍(lán)三角是scRNA檢測(cè)的下調(diào)DEGs
通路的改變和CRC中的CAFs多樣性
通路改變
利用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)鑒定了四種細(xì)胞類(lèi)型的上游調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)前3名的元件包含了2個(gè)小分子：放線酰胺素Actinonin和莫特沙芬釓 Motexafin gadolinium揩瞪。Actinonin在多種癌癥細(xì)胞（包括結(jié)腸直癌）中起到抑制生長(zhǎng)的作用，Motexafin gadolinium主要在干細(xì)胞中發(fā)揮作用篓冲，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡
另外李破，TGFB1( transforming growth factor B1)是排名最高的內(nèi)源性上游調(diào)控因子宠哄，在CAFs激活通路中活性增強(qiáng)，同時(shí)SMAD3（ TGF-β effector ）也增強(qiáng)嗤攻。另外TGFB3和LTPB1(編碼 TGF-β結(jié)合蛋白)在CAFs中表達(dá)比正常黏膜成纖維細(xì)胞表達(dá)更多毛嫉。在正常黏膜成纖維細(xì)胞中，TGF-β響應(yīng)基因如TGFBI, CTGF and BHLHE40 主要在pithelial cells 和CAFs 中表達(dá)妇菱，說(shuō)明由CAFs分泌的TGF-β可能激活腫瘤上皮細(xì)胞中的TGF-β通路承粤。
圖b是TGF-β 信號(hào)通路；d：正常黏膜與CRC主要細(xì)胞類(lèi)型的TGF-β信號(hào)通路中基因表達(dá)量熱圖(采用 log10 (FPKM)
CRC中的CAFs多樣性
上圖中紅色的CAFs的一些TGF-β基因表現(xiàn)出了"雙峰表達(dá)Bimodal expression"的情況(遺傳相同表型多樣)闯团，然后用RCA的self-projection模式對(duì)CAFs進(jìn)行聚類(lèi)辛臊，分成了NMFs(normal mucosa fibroblasts)、CAF-A and CAF-B三類(lèi)房交，之后CAF-B細(xì)胞基因差異分析得到marker基因ACTA2,TAGLN and PDGFA 上調(diào)表達(dá)彻舰，它們?cè)贑AF-A中下調(diào)；CAF-A中上調(diào)的有MMP2,DCN and COL1A2
因此候味，CRC腫瘤中的CAFs主要有兩種亞型刃唤，具有不同的轉(zhuǎn)錄表達(dá)
分子表型分析干細(xì)胞特性和EMT
干細(xì)胞特性(stemness)
利用SI(stemness index) 【由已知的42種結(jié)腸或腸道干細(xì)胞marker基因平均表達(dá)水平得到】在腫瘤和正常組織中的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的SI值更高白群，約5%的腫瘤細(xì)胞SI值高于正常組織尚胞。然后將干細(xì)胞的SI值與基因表達(dá)量結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)基因與干細(xì)胞作用相關(guān)帜慢，其中有3個(gè)與WNT信號(hào)通路相關(guān)(GPX2笼裳，OLFM4 and RNF43)。
有趣的是崖堤，lncRNA編碼基因XIST （可以介導(dǎo)女性X染色體失活）也被發(fā)現(xiàn)與干細(xì)胞性相關(guān)侍咱，不過(guò)在正常樣本中XIST 與SI評(píng)分無(wú)關(guān)。
總的來(lái)說(shuō)密幔，腫瘤干細(xì)胞的特性是一個(gè)不斷變化的過(guò)程楔脯，并與XIST和WNT介質(zhì)的表達(dá)相關(guān)
上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）
之前有一種假設(shè)："上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)狀態(tài)，這樣就允許它脫離并轉(zhuǎn)移到其它位置"胯甩，轉(zhuǎn)錄水平上昧廷，EMT的特征是上皮組織的marker CDH1 下調(diào)表達(dá)，間充質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子TWIST, SNAIL and ZEB家族的上調(diào)表達(dá)偎箫。為了檢測(cè)CRC中的EMT發(fā)展情況木柬，檢測(cè)了以上基因及其它細(xì)胞類(lèi)型的marker基因的表達(dá)
橙色為EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子log10(FPKM)值，灰色部分是一些細(xì)胞類(lèi)型marker基因的表達(dá)量
并沒(méi)有觀察到腫瘤和正常粘膜上皮細(xì)胞的CDH1的表達(dá)差異淹办，而且腫瘤與正常組織上皮細(xì)胞都沒(méi)檢測(cè)到EMT轉(zhuǎn)錄因子眉枕。相反，發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子在CAFs（圖中紅色區(qū)域）中上調(diào)，不過(guò)這個(gè)變化和EMT的發(fā)生沒(méi)有直接關(guān)系速挑，因?yàn)閒ibroblast(成纖維細(xì)胞是間充質(zhì)細(xì)胞)谤牡。為了進(jìn)一步研究，文章結(jié)合了上圖中的9個(gè)EMT上調(diào)基因的表達(dá)量姥宝，定義了每個(gè)細(xì)胞中EMT的評(píng)分翅萤，確定了腫瘤上皮細(xì)胞缺乏EMT信號(hào)，而CAFs中EMT信號(hào)顯著增強(qiáng)腊满。
之后為了排除組織切除帶來(lái)的人工干擾套么，又使用了單分子FISH(smFISH)對(duì)腫瘤mRNA分子進(jìn)行可視化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EMT的marker SNAI1碳蛋、ZEB1和TWIST1 的表達(dá)與成纖維細(xì)胞的marker SPARC 表達(dá)一致胚泌，并且在表達(dá)EPCAM的上皮細(xì)胞中檢測(cè)不到。免疫組化與生信分析結(jié)果是一致的疮蹦。
根據(jù)不同患者的生存率將CRC分成亞組
目前已經(jīng)利用常規(guī)bulk轉(zhuǎn)錄組根據(jù)治療反應(yīng)和患者生存率诸迟，將CRC分成不同亞型。但是這種分類(lèi)會(huì)受到不同類(lèi)型間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響愕乎。因此文章利用了scRNA得到的6這種細(xì)胞型阵苇，然后結(jié)合了6個(gè)獨(dú)立的帶有生存信息注釋的常規(guī)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)：TCGA、GSE14333感论、PRECOG37以及一項(xiàng)相關(guān)研究的三個(gè)數(shù)據(jù)集绅项。將bulk數(shù)據(jù)投射到6個(gè)細(xì)胞型上，并在每個(gè)細(xì)胞型中都鑒定到了三個(gè)腫瘤組：S1比肄、S2快耿、S3（圖a）。其中S1腫瘤上皮細(xì)胞特征較弱芳绩，成纖維細(xì)胞較強(qiáng)掀亥，髓樣特征較強(qiáng)；S2所有特征處于中等水平妥色；S3上皮細(xì)胞特征較強(qiáng)搪花，其余較弱（圖b）。
接著討論了新定義的CRC亞型的預(yù)后意義嘹害。6個(gè)細(xì)胞型中撮竿，S3腫瘤生存率最高(圖a)，這和之前研究成纖維細(xì)胞與患者預(yù)后的關(guān)系結(jié)果一致笔呀。來(lái)自GSE14333數(shù)據(jù)集的bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中 ‘enterocyte’ and ‘goblet-like’ CRC腫瘤亞型中包含了這里分析的S2幢踏、S3亞型（圖c）。在 ‘enterocyte’ 和 ‘goblet-like’ 亞型中许师，S3腫瘤比S2的存活率更高房蝉。進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了CAFs與CRC預(yù)后的潛在相關(guān)性 僚匆，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組推斷的細(xì)胞類(lèi)型對(duì)預(yù)后具有一定的價(jià)值。
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