要實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞mRNA測(cè)序，需要解決2個(gè)難題：

• 1. 一個(gè)人類細(xì)胞中筝尾，RNA總量大約只有10pg左右（1pg=10^-12g）捡需，其中mRNA的量大約只有0.2pg。要把這么少的mRNA轉(zhuǎn)變成越零點(diǎn)幾個(gè)ug（1ug=10^-6g）以上的核酸文庫(kù)忿等，意味著核酸的擴(kuò)增量要達(dá)到幾百萬(wàn)倍以上栖忠。 如何在核酸擴(kuò)增過(guò)程中不引入太多的PCR偏差，一直是個(gè)大問(wèn)題贸街。所謂PCR偏差庵寞，就是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，某些片段被大量擴(kuò)增薛匪，而大部分片段被擴(kuò)增的量很少捐川，甚至沒(méi)有被擴(kuò)增。這就導(dǎo)致高通量測(cè)序只能測(cè)到所有樣本中很少的一部分片段序列逸尖。PCR偏差會(huì)隨著PCR循環(huán)次數(shù)的增多而指數(shù)放大古沥。那么在這種情況下瘸右，一方面要把核酸擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍甚至更多的倍數(shù)，另一方面又想得到均一覆蓋的文庫(kù)岩齿，這就是單細(xì)胞mRNA建庫(kù)當(dāng)中太颤，所要解決的第一個(gè)大難題。
• 2. 第二個(gè)難題是如何盡可能高效地得到mRNA文庫(kù)盹沈，而不是含了大量rRNA序列的文庫(kù)龄章。因?yàn)閞RNA在總RNA當(dāng)中占了95%甚至更高的比例，而 mRNA在總RNA中只占了2%-3%的比例乞封。如果不加區(qū)分的進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再擴(kuò)增建庫(kù)做裙，很可能測(cè)序得到的絕大部分序列都是rRNA的序列。但是rRNA序列不能給我們帶來(lái)有效的生物信息肃晚，只有mRNA序列锚贱，才是我們想要的信息。因此关串，如何能夠選擇性地把mRNA轉(zhuǎn)化成測(cè)序文庫(kù)拧廊，并且避免把rRNA帶到測(cè)序文庫(kù)中來(lái)，這就是單細(xì)胞mRNA建庫(kù)當(dāng)中悍缠，要解決的第二個(gè)大難題卦绣。

1. Clontech公司推出的SMART方法

1.1 簡(jiǎn)介

SMART方法的全稱是Switching Mechanism at 5' End of RNA Template，該方法發(fā)表于于2012年^[1]飞蚓，2013年發(fā)表了其改進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用Smart-Seq2^[2]滤港，2014年Smart-Seq2 protocol發(fā)表^[3]。Smart-Seq2對(duì)原始的Smart-Seq實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行了多項(xiàng)改進(jìn)優(yōu)化趴拧，它不再需要純化步驟溅漾，可大大提高產(chǎn)量，最重要的改進(jìn)是下面兩項(xiàng)：
（1）TSO 3'端最后一個(gè)鳥苷酸替換為鎖核酸LNA(locked nucleic acid)著榴。LNA單體的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)添履，其退火溫度增強(qiáng)非模板cDNA的3'延伸能力。
（2）甜菜堿（一種具有兩個(gè)重要作用的甲基供體：它會(huì)增加蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性脑又，并通過(guò)破壞DNA螺旋來(lái)降低甚至消除了DNA熱融變對(duì)堿基對(duì)組成的依賴性）與較高的MgCl2濃度結(jié)合使用暮胧。解決某些RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（例如發(fā)夾或環(huán)）由于空間位阻复罐，可能導(dǎo)致酶終止鏈延長(zhǎng)的問(wèn)題穴店。

Smart技術(shù)是基于高保真的反轉(zhuǎn)錄酶、模板轉(zhuǎn)換和前置放大來(lái)增加cDNA得率蚕礼，實(shí)驗(yàn)流程2天严卖，得到的是全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本席舍。該方法有較好的覆蓋范圍，可檢測(cè)到稀有轉(zhuǎn)錄本哮笆，因此應(yīng)用范圍較廣来颤。

1.2 建庫(kù)原理

建庫(kù)流程圖總覽

Smart-Seq2建庫(kù)原理

1. 單細(xì)胞分選：使用流式細(xì)胞儀或顯微操作進(jìn)行細(xì)胞分選汰扭，體積不超過(guò)0.5 ul。

2. 細(xì)胞裂解：將分離細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移到細(xì)胞裂解液中進(jìn)行細(xì)胞裂解福铅。

3. 反轉(zhuǎn)錄（ 一鏈合成 ）：使用Oligo(dT) primer 對(duì)帶有polyA尾的RNA( 主要mRNA )進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄萝毛。

這個(gè)逆轉(zhuǎn)錄的起始引物先是一段通用序列，會(huì)用作PCR擴(kuò)增的引物識(shí)別序列滑黔。中間是一長(zhǎng)串的T珊泳，這些T專門識(shí)別mRNA的3‘末端的Poly(A)尾巴序列，與Poly(A)尾互補(bǔ)結(jié)合拷沸。引物最末端有一個(gè)定位結(jié)構(gòu)，在3‘末端的倒數(shù)第二個(gè)堿基是一個(gè)非T的簡(jiǎn)并堿基（V表示A/C/G）薯演。最后一個(gè)堿基則是簡(jiǎn)并堿基N（A/C/T/G都有可能）撞芍。引物的這個(gè)末端結(jié)構(gòu)，就是讓它正好結(jié)合在mRNA的3‘端連到Poly(A)尾巴的連接處跨扮，而不會(huì)結(jié)合到mRNA別的地方序无。這樣就保證了逆轉(zhuǎn)錄的起始位置正好是mRNA的3'端的序列終止位置。

由于使用了特殊活性反轉(zhuǎn)錄酶（Moloney Murine Leukemia Virus , MMLV,莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄衡创，所以在它轉(zhuǎn)錄到mRNA的5'末端的時(shí)候帝嗡，會(huì)在cDNA鏈3'端加上幾個(gè)不依賴于模版的C堿基。

4. 模板置換（ 二鏈合成 ）：該步使用TSO（template-switching oligo, 特異性模板轉(zhuǎn)換引物）引物合成了cDNA的二鏈璃氢，從而置換了與一鏈cDNA互補(bǔ)的RNA哟玷。

要注意的是TSO引物的 3'端有三個(gè)非脫氧的G堿基（RNA的G堿基），能與一鏈3'端MMLV多合成的幾個(gè)C堿基互補(bǔ)一也，而最末端的+G是一個(gè)修飾過(guò)的G巢寡，能增加TSO的熱穩(wěn)定性，以及其與一鏈cDNA游離的3’端的互補(bǔ)的能力椰苟∫衷拢互補(bǔ)雜交之后，可以引導(dǎo)MMLV酶再次發(fā)揮聚合作用舆蝴，以剛才那條新合成的cDNA為模版來(lái)復(fù)制得到雙鏈cDNA谦絮。

這個(gè)雙鏈cDNA兩端都已經(jīng)接好了我們?nèi)斯ぴO(shè)計(jì)的PCR引物序列（紅圈），然后就加入常規(guī)PCR引物洁仗，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增层皱。

5. PCR擴(kuò)增：該步進(jìn)行輕度的cDNA富集，將cDNA擴(kuò)增至ng級(jí)即可京痢。

6. 標(biāo)記：利用改造后的高活性Tn5轉(zhuǎn)座酶對(duì)DNA進(jìn)行打斷的同時(shí)將接頭添加到cDNA的兩端奶甘。標(biāo)記完成后的DNA片段通常在200-600bp。

7. PCR富集及上機(jī)測(cè)序：在進(jìn)行最后一次PCR擴(kuò)增后祭椰，即可上機(jī)測(cè)序臭家。

3個(gè)巧妙點(diǎn)：
1. 先用一個(gè)定位引物疲陕，保證cDNA的合成是從mRNA的3'最末端開始的。同時(shí)讓合成的cDNA在下游連上了一個(gè)通用PCR序列钉赁。
2. 利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶在新合成cDNA的3'端多加幾個(gè)C堿基的特點(diǎn)蹄殃，再用有3個(gè)G堿基的上游引物進(jìn)行第二鏈的合成。這也就保證了只有完整的cDNA也就是那些帶多個(gè) C的cDNA（第一鏈）才能合成出cDNA第二鏈你踩。這就保證了雙鏈cDNA是全長(zhǎng)的cDNA诅岩。
3. 保證了PCR擴(kuò)增效率的一致性。PCR擴(kuò)增效率的最主要的影響因素是引物的序列带膜，現(xiàn)在因?yàn)閏DNA的5‘端和3’端都分別引入了統(tǒng)一的引物序列吩谦，就去除了因?yàn)橐镄蛄械牟煌餚CR效率不同這個(gè)最主要的偏差因素。也就在較大程度上保證了PCR擴(kuò)增效率的一致性膝藕，減少了PCR偏差式廷。

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用SMART方法芭挽，對(duì)一個(gè)細(xì)胞也就是10pg總RNA進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序滑废，RPKM為10的這些基因，有60%是被測(cè)序測(cè)到的袜爪。對(duì)RPKM為100的這些基因蠕趁，有90%是可以被測(cè)序測(cè)到的，而且被測(cè)到的幾率波動(dòng)很小辛馆。

這說(shuō)明SMART方法是一個(gè)有效的單細(xì)胞mRNA測(cè)序的方法俺陋。

Smart-Seq2優(yōu)點(diǎn)：

• 相比于截短的cDNAs，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶更傾向于選擇全長(zhǎng)cDNAs作為其末端轉(zhuǎn)移酶活性的底物怀各。因此每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的所有外顯子都能被檢測(cè)到倔韭。這使它可以用于檢測(cè)可變剪切，還能在轉(zhuǎn)錄層面進(jìn)行全面的SNP和突變分析瓢对，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍寿酌。
• 不同I5、I7 Index組合使其能夠進(jìn)行多樣本混合測(cè)序硕蛹。
• 方案和原理公開醇疼，讓研究者可以進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行改良。目前在這個(gè)方案的基礎(chǔ)上涌現(xiàn)了很多單細(xì)胞測(cè)序的新成果法焰。
• 和10x Genomics相比秧荆，單細(xì)胞檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本更多。

Smart-Seq2缺點(diǎn)：

• 由于對(duì)聚腺苷酸化的RNA具有選擇性埃仪，所以不能分析非poly(A)的RNA乙濒。
• 測(cè)序reads不帶有mRNA鏈特異性。

2. TargetAmp方法

2.1 簡(jiǎn)介

TargetAmp方法由Illumina公司旗下的EpiCentre公司開發(fā)，可以把少量RNA（最少到1個(gè)細(xì)胞颁股，約10pg）擴(kuò)增到ng級(jí)么库，以達(dá)到可以進(jìn)行高通量測(cè)序所需的核酸量。

2.2 建庫(kù)原理

建庫(kù)流程圖總覽

建庫(kù)原理

1. 第一鏈cDNA合成：用T7-Oligo(dT)的引物進(jìn)行cDNA合成

這個(gè)引物在5'端設(shè)計(jì)了一個(gè)T7啟動(dòng)子序列甘有，3'端是多個(gè)T堿基诉儒，可以與mRNA的poly(A)尾巴相結(jié)合，作為逆轉(zhuǎn)錄的起始引物亏掀。

逆轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA被引入了一個(gè)T7啟動(dòng)子忱反。

2. cDNA第二鏈的合成：使用RNase H酶特異性降解RNA和DNA雜交鏈中的RNA鏈，剩下帶有T7啟動(dòng)子的cDNA單鏈滤愕，再合成出第二條cDNA鏈來(lái)温算。

3. 得到的雙鏈cDNA可以作為轉(zhuǎn)錄的模板，利用鏈上的T7啟動(dòng)子间影，啟動(dòng)體外轉(zhuǎn)錄生成大量反義aRNA（antisense-RNA）

4. 純化aRNA

5. 第二輪的第一鏈cDNA合成：使用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄米者，得到第二輪cDNA

6. 第二輪中的第二鏈cDNA合成：用RNase H把DNARNA雜交產(chǎn)物中的RNA消化掉。用T7-Oligo(dT)引物粘到第二輪cDNA的poly(A)尾巴上宇智，合成出cDNA雙鏈。

7. 這個(gè)雙鏈cDNA再經(jīng)過(guò)第二輪的轉(zhuǎn)錄胰丁，又得到第二輪的反義RNA随橘。

這些第二輪的反義RNA的量，足以達(dá)到微克級(jí)锦庸。再經(jīng)過(guò)一輪逆轉(zhuǎn)錄机蔗，就可以得到幾個(gè)微克的cDNA，足以進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序之用甘萧。

本方法的巧妙之處：
1. 它不是用PCR來(lái)擴(kuò)增核酸萝嘁，而是用轉(zhuǎn)錄的方法來(lái)增加核酸的量。因?yàn)閿U(kuò)增那么多倍的核酸扬卷，如果用PCR牙言，需要幾十個(gè)循環(huán)。那么PCR不同的擴(kuò)增子的擴(kuò)增效率怪得，即使一開始是很小的差異咱枉，也會(huì)在幾十個(gè)循環(huán)中被指數(shù)放大，變成一個(gè)很大的差異徒恋。TargetAmp用轉(zhuǎn)錄的方法蚕断，統(tǒng)一都用T7這個(gè)啟動(dòng)子，它轉(zhuǎn)錄的起始效率大體上就保持了一致入挣。它的每一輪轉(zhuǎn)錄亿乳，都把核酸的量擴(kuò)大了幾千倍，經(jīng)過(guò)兩輪的擴(kuò)增径筏，就把核酸的量擴(kuò)大了百萬(wàn)倍葛假。這樣一方面得到了足以用來(lái)建庫(kù)的高達(dá)幾微克的核酸障陶，另一方面又避免了PCR過(guò)程，也就避免了PCR擴(kuò)增偏差桐款。
2. 第一輪與第二輪都是線性擴(kuò)增咸这，大大減少了PCR反應(yīng)的指數(shù)效應(yīng)所引起的Bias。
3. 高效擴(kuò)增魔眨，一輪擴(kuò)增可以擴(kuò)增幾千倍媳维，把10pg級(jí)的Total RNA中的mRNA擴(kuò)增到幾個(gè)ng，達(dá)到二代測(cè)序的樣本量要求遏暴。如果經(jīng)過(guò)兩輪擴(kuò)增侄刽，就可以達(dá)到生物芯片所需的ug級(jí)的核酸量。

3. 10X genomics

3.1 簡(jiǎn)介

10X genomics是把微珠加DNA標(biāo)簽朋凉、微滴發(fā)生州丹、酶反應(yīng)和高通量測(cè)序后的數(shù)據(jù)分析這一系列的技術(shù)整合在一起的一個(gè)基于油包水乳濁液酶反應(yīng)原理的分子生物學(xué)分析系統(tǒng)。該方法基于微流控技術(shù)（Microfluidics-based approaches）^[4]杂彭，與SMART有相似的分子生物學(xué)原理墓毒，運(yùn)用了模板轉(zhuǎn)換技術(shù)，但與SMART的細(xì)胞捕獲和通量不同亲怠。
Droplet-based方法是將單個(gè)細(xì)胞包裹在一個(gè)小油滴中（含有barcode和RT primer）反轉(zhuǎn)錄成cDNA所计，然后油滴破裂釋放cDNA，統(tǒng)一進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建团秽，增大了實(shí)驗(yàn)通量主胧，但需要專門的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。

3.2 10X工作原理

Gel beads及其核酸序列構(gòu)成

Gel beads习勤，即凝膠微珠踪栋。每個(gè)凝膠微珠上有40-80萬(wàn)特定的核酸引物序列，該序列由以下幾部分構(gòu)成：
1）Read 1 測(cè)序引物
2）10X Barcode序列：16堿基图毕，一個(gè)Gel bead對(duì)應(yīng)一種10X Barcode夷都，共有~350W種10X Barcode，用于區(qū)分細(xì)胞予颤。任意兩個(gè)barcode之間至少差2個(gè)或2個(gè)以上的堿基（避免誤讀）损肛。
3）UMI（unique molecular identifier）：12堿基，隨機(jī)序列荣瑟，作用是在經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增再深度測(cè)序得到的Reads治拿，可以看出哪些reads是來(lái)自于一個(gè)原始的cDNA分子，用于區(qū)分同一細(xì)胞的不同轉(zhuǎn)錄本笆焰〗倭拢可以排除各種cDNA因?yàn)镻CR擴(kuò)增效率的不同而導(dǎo)致的reads數(shù)的偏差（PCR bias）。
4）poly dT反轉(zhuǎn)錄引物：30nt，作用是與mRNA的Poly(A)尾巴結(jié)合捏检，作為逆轉(zhuǎn)錄的引物荞驴，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA來(lái)。

一個(gè)凝膠微珠上的40-80萬(wàn)核酸引物序列的barcode是一樣的贯城，但UMI不同

芯片上的液流管路

經(jīng)過(guò)這個(gè)系統(tǒng)熊楼，制備出油包水小液滴的乳濁液。這些小液滴里面是水相能犯，外面包裹的是油相鲫骗。

細(xì)胞混懸液中約65%的細(xì)胞會(huì)被包到有微珠的小液滴當(dāng)中。這些液滴中包含細(xì)胞的數(shù)目是符合泊松分布的踩晶，大部分細(xì)胞會(huì)被單獨(dú)包裹在一個(gè)小液滴中执泰。

測(cè)序文庫(kù)制備

1. 在得到乳濁液之后，將細(xì)胞膜破掉渡蜻，讓細(xì)胞當(dāng)中的mRNA游離出來(lái)术吝。游離出來(lái)的mRNA與小液滴中的水相混合，也就是和逆轉(zhuǎn)錄酶茸苇、結(jié)合在凝膠微珠上的核酸引物排苍、以及dNTP底物相接觸。

2. 接著發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)学密，mRNA與凝膠微珠上帶標(biāo)簽的DNA分子相結(jié)合纪岁，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈（下圖紫色序列）则果。

這樣得到的cDNA分子第一鏈?zhǔn)菐в羞@個(gè)微珠所特有的Barcode標(biāo)簽和各自特定的UMI標(biāo)簽的。有了這兩個(gè)標(biāo)簽漩氨，cDNA分子就可以互相區(qū)分開來(lái)西壮。

3. 以SMART方式使用TSO引物完成第二鏈合成

4. 油滴破碎，磁珠純化cDNA一鏈叫惊，然后PCR擴(kuò)增cDNA款青。

5. cDNA擴(kuò)增完成后酶切片段化并磁珠篩選最適片段，通過(guò)末端修復(fù)霍狰、加A抡草、接頭連接Read2測(cè)序引物，再以PCR方式構(gòu)建含有P5和P7接頭的cDNA文庫(kù)即可蔗坯。

隨后就可以進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)分析了康震。

10X genomics優(yōu)點(diǎn)：

• 簡(jiǎn)單便捷：集單細(xì)胞分選、擴(kuò)增宾濒、建庫(kù)于一體腿短。
• 細(xì)胞通量高：每個(gè)樣本細(xì)胞數(shù)可以達(dá)到5000-10000個(gè)。
• 建庫(kù)周期短：1天可以完成單細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞捕獲橘忱、擴(kuò)增及建庫(kù)赴魁。
• 捕獲效率高：?jiǎn)蝹€(gè)液滴捕獲效率高達(dá)65%
• 真正意義的單細(xì)胞：?jiǎn)蝹€(gè)液滴捕獲到多細(xì)胞概率極低（0.9%/1000cells）

10X genomics缺點(diǎn)：

• 非全長(zhǎng)信息：只能獲得3‘端轉(zhuǎn)錄本信息
• 樣本要求高：?jiǎn)蝹€(gè)樣本細(xì)胞起適量達(dá)5x10⁴ - 5x10⁵個(gè)，活細(xì)胞數(shù)目需要超過(guò)80%钝诚，最好在90%以上颖御。

4. 多種方法的比較

10X和SMART的比較，出自張澤民團(tuán)隊(duì)^[5]

2017年Molecular Cell文章凝颇，對(duì)6種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的比較^[6]

2019年Nature Communications文章潘拱，對(duì)7種單細(xì)胞RNA測(cè)序方法進(jìn)行比較^[7]

7種單細(xì)胞RNA測(cè)序方法比較

參考文獻(xiàn)：

1. Ramskold, D., et al., Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol, 2012. 30(8): p. 777-82.

2. Picelli, S., et al., Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods, 2013. 10(11): p. 1096-8.

3. Picelli, S., et al., Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc, 2014. 9(1): p. 171-81.

4. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 2015;161(5):1202-1214.

5. Direct Comparative Analyses of 10X Genomics Chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2021 Mar 1:S1672-0229(21)00048-6.

6. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Mol Cell. 2017;65(4):631-643.e4.

7. A systematic evaluation of single cell RNA-seq analysis pipelines. Nat Commun. 2019;10(1):4667.

參考：
陳巍學(xué)基因：?jiǎn)渭?xì)胞mRNA測(cè)序
陳巍學(xué)基因：10X Genomics分析單細(xì)胞表達(dá)
丁香通：技術(shù)解讀｜單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組：Smart-seq 2還是10X Genomics Chromium?