自2009年首篇單細(xì)胞測(cè)序文章的發(fā)表冈涧、2013年《Science》將單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)列為年度最值得關(guān)注的技術(shù)榜首以來屈糊，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在這十幾年間不斷地發(fā)展，特別是近幾年奕枝，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)得到了爆發(fā)式的發(fā)展與普及哥谷，已然成為研究者們的基礎(chǔ)研究利器岸夯。那么，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（scRNA-seq）相較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序到底有著什么優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)呢们妥？
接下來猜扮，我們就以當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的10x Genomics 3’單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為例，依次從技術(shù)概況监婶、核心原理&實(shí)驗(yàn)流程旅赢、數(shù)據(jù)分析策略齿桃、應(yīng)用領(lǐng)域及案例、樣本準(zhǔn)備及運(yùn)輸注意事項(xiàng)等方面煮盼，為您詳細(xì)介紹和解析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)短纵。
技術(shù)概況
什么是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)？
細(xì)胞異質(zhì)性是生物組織的普遍特征僵控。由于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)的測(cè)序水平是在個(gè)體或群體水平上對(duì)數(shù)萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序香到，因此傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的測(cè)序結(jié)果就只能檢測(cè)到個(gè)體間或者群體間的轉(zhuǎn)錄組差異，而細(xì)胞間的轉(zhuǎn)錄差異則無法精確地檢測(cè)到报破。而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)則提供了一種在單個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)悠就，能夠有效解決細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性以細(xì)胞群間轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的難題。
百奧智匯10x Genomics 3’單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序采用10x Genomics最新的Chromium平臺(tái)充易，能夠在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)mRNA進(jìn)行高通量測(cè)序梗脾。該技術(shù)具有高通量、高精準(zhǔn)度特點(diǎn)蔽氨，能夠一次性分離數(shù)百至數(shù)萬個(gè)細(xì)胞藐唠，將分離細(xì)胞中的微量mRNA高效擴(kuò)增后測(cè)序。目前鹉究，該技術(shù)已在生殖宇立、免疫、干細(xì)胞分化自赔、腫瘤異質(zhì)性妈嘹、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、腦發(fā)育等多個(gè)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用绍妨，以評(píng)估腫瘤異質(zhì)性和干細(xì)胞組成润脸，剖析神經(jīng)元群體、細(xì)胞表型分析他去、鑒定新的疾病靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物毙驯、追蹤細(xì)胞譜系、分析細(xì)胞狀態(tài)動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化等灾测。
核心原理&實(shí)驗(yàn)流程
10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)如何在單細(xì)胞維度上獲取基因表達(dá)信息爆价？
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的顯著優(yōu)勢(shì)在于能夠在單細(xì)胞水平上對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，即在更高分辨率的水平下對(duì)細(xì)胞的差異表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)媳搪。因此铭段，該技術(shù)的核心在于能夠成功區(qū)分樣品中的不同單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本。10x Genomics平臺(tái)利用微流控技術(shù)秦爆，結(jié)合Barcode-單細(xì)胞-油滴的對(duì)應(yīng)關(guān)系序愚，最終得到了捕獲單個(gè)細(xì)胞的“膠珠”，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的單細(xì)胞測(cè)序等限。
該方法的基本實(shí)驗(yàn)流程包括細(xì)胞懸液制備爸吮，加條碼和文庫(kù)構(gòu)建芬膝、高通量測(cè)序、數(shù)據(jù)分析和可視化報(bào)告拗胜。使用該平臺(tái)前先要對(duì)樣本進(jìn)行解離蔗候，以制備符合上機(jī)要求的單細(xì)胞懸液。在完成細(xì)胞懸液的制備后埂软，即可將懸液和建庫(kù)試劑加入芯片锈遥，然后上機(jī)。該儀器基于微流控技術(shù)勘畔，能將單個(gè)細(xì)胞與帶有條形碼和引物的凝膠珠包裹到微液滴中所灸，完成單個(gè)細(xì)胞的捕獲。單個(gè)細(xì)胞捕獲完成后炫七，在微液滴中進(jìn)行細(xì)胞裂解爬立，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA并擴(kuò)增，最后進(jìn)行高通量測(cè)序万哪。
該方法的核心在于凝膠珠的設(shè)計(jì)——每個(gè)凝膠珠上包含數(shù)十萬條探針侠驯，這些探針由TruSeq Read 1、10x Barcode奕巍、UMI及Poly（dT）VN組成吟策，分別用于結(jié)合測(cè)序時(shí)所需要的引物序列、區(qū)分不同微液滴中的單個(gè)細(xì)胞的止、區(qū)分同一細(xì)胞中不同的mRNA序列以及捕獲細(xì)胞中的mRNA檩坚。最終測(cè)序所得的序列將根據(jù)10x Barcode及UMI序列來對(duì)不同的單細(xì)胞和同一細(xì)胞中不同的mRNA序列進(jìn)行區(qū)分，最終得到單細(xì)胞分辨率下的表達(dá)譜诅福。
數(shù)據(jù)分析策略
如何分析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)匾委？
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的一般流程包括細(xì)胞質(zhì)控、批次評(píng)估/校正氓润、降維聚類赂乐、分群注釋、差異表達(dá)咖气、富集分析沪猴、擬時(shí)分析、細(xì)胞間相互作用分析和其它深度分析采章。其中，細(xì)胞質(zhì)控是為了剔除低質(zhì)量的細(xì)胞壶辜；批次評(píng)估/校正是為了去除批次效應(yīng)對(duì)數(shù)據(jù)的扭曲悯舟；降維聚類是為了將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)榈途S可視化結(jié)果；分群注釋是為了對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定以找出特異性的細(xì)胞類型砸民；差異表達(dá)是為了獲得細(xì)胞類群間/不同分組間的差異表達(dá)/特征基因抵怎；富集分析是為了揭示特定細(xì)胞亞群參與的生物學(xué)過程奋救，確定其生物學(xué)功能；擬時(shí)分析能夠揭示細(xì)胞亞群間在時(shí)間上的動(dòng)態(tài)變化和前后發(fā)育關(guān)系反惕；細(xì)胞間相互作用分析能夠了解某一細(xì)胞亞群是通過哪些受配體尝艘、影響哪些其它細(xì)胞亞群來行使其生物學(xué)功能的。此外姿染，還有一些深度分析方法可根據(jù)特定研究目的進(jìn)行設(shè)計(jì)和使用背亥。
應(yīng)用領(lǐng)域
腫瘤治療和免疫系統(tǒng)發(fā)育等領(lǐng)域
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)槲覀兲峁┝艘粋€(gè)在單細(xì)胞分辨率上研究細(xì)胞基因表達(dá)圖譜的研究工具。截至目前悬赏，該技術(shù)已在評(píng)估腫瘤異質(zhì)性和干細(xì)胞組成狡汉，剖析神經(jīng)元群體、細(xì)胞表型分析闽颇、鑒定新的疾病靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物盾戴、追蹤細(xì)胞譜系、分析細(xì)胞狀態(tài)動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化等研究領(lǐng)域的研究中發(fā)揮重要作用兵多。接下來我們以兩個(gè)典型例子來說明該技術(shù)在具體研究中的應(yīng)用尖啡。
應(yīng)用實(shí)例1：
精細(xì)刻畫結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境
2020年4月16日，張澤民教授團(tuán)隊(duì)在Cell上發(fā)表了題為“Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer”的研究論文剩膘。該研究通過10x Genomics scRNA-seq和Smart-seq2兩種不同的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)衅斩，對(duì)患者腫瘤微環(huán)境中的各類細(xì)胞進(jìn)行分析，揭示了各類細(xì)胞的特征援雇、譜系發(fā)育情況及相互作用情況矛渴，深刻地揭示腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞異質(zhì)性”共基于上述結(jié)果具温，進(jìn)一步利用小鼠模型的單細(xì)胞測(cè)序揭示了兩種靶向抗癌藥物的作用機(jī)制。
該研究通過使用兩種單細(xì)胞技術(shù)對(duì)結(jié)直腸癌患者的腫瘤微環(huán)境筐赔，特別是浸潤(rùn)髓系細(xì)胞類群進(jìn)行了系統(tǒng)性的刻畫铣猩，分析了TAM（腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞）和DC（樹突狀細(xì)胞）細(xì)胞的類群特征、譜系發(fā)育及其與T細(xì)胞的其他細(xì)胞間相互作用關(guān)系茴丰〈锩螅基于以上結(jié)果，分別對(duì)接受anti-CSF1R抑制劑和anti-CD40激動(dòng)劑的小鼠模型進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序贿肩，揭示了這兩種靶向髓系細(xì)胞的免疫治療策略潛在的作用機(jī)理峦椰，從而為靶向腫瘤微環(huán)境的腫瘤免疫治療提供了更詳細(xì)的理論基礎(chǔ)。
應(yīng)用實(shí)例2：
免疫系統(tǒng)圖譜的繪制
人體妊娠期的免疫系統(tǒng)在多個(gè)部位同時(shí)發(fā)育汰规。在肝臟和骨髓成為主要造血部位之前汤功，免疫細(xì)胞依次由胚胎外卵黃囊祖細(xì)胞和主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)的造血干細(xì)胞（HSCs）分化。造血部位免疫細(xì)胞會(huì)發(fā)育為胸腺溜哮、脾臟滔金、淋巴結(jié)等淋巴器官和外周非淋巴器官色解。然而，目前我們對(duì)妊娠期免疫系統(tǒng)的發(fā)育或妊娠期不同免疫器官的相互影響的具體情況仍不明了餐茵。
2022年5月12日科阎，來自劍橋大學(xué)威康桑格研究所的研究團(tuán)隊(duì)在Science上發(fā)表題為“Mapping the developing human immune system across organs”的文章，基于scRNA-seq忿族、scVDJ-seq和空間轉(zhuǎn)錄組分析構(gòu)建了發(fā)育中的人類免疫系統(tǒng)锣笨，對(duì)妊娠中期的各類免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化進(jìn)行了表征。此外肠阱，研究還發(fā)現(xiàn)全系統(tǒng)的血液和免疫細(xì)胞的發(fā)育超過了傳統(tǒng)的初級(jí)造血器官票唆，并基于TCR基因的使用和體外人工胸腺組織培養(yǎng)，為αβTCR非常規(guī)T細(xì)胞的選擇起源提供了證據(jù)屹徘。
百奧智匯已對(duì)該研究進(jìn)行了詳細(xì)解讀走趋，更多細(xì)節(jié)請(qǐng)點(diǎn)擊：文獻(xiàn)解讀 | 繪制發(fā)育中的人體免疫系統(tǒng)跨器官圖譜。
樣本準(zhǔn)備及運(yùn)輸注意事項(xiàng)
如何準(zhǔn)備一個(gè)合格的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組樣本噪伊？
目前簿煌，百奧智匯可承接基于10x Genomics的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)和分析，接收多種類型的樣本鉴吹，包括組織姨伟、血液和細(xì)胞等。良好的樣本準(zhǔn)備流程及運(yùn)輸過程對(duì)該實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要豆励，因此我們總結(jié)了一些樣本準(zhǔn)備流程和運(yùn)輸注意事項(xiàng)夺荒，希望能夠?qū)Υ蠹业恼n題研究提供幫助。
樣品準(zhǔn)備
新鮮組織：取至少250 mm3體積的樣品量良蒸，使用1640培養(yǎng)基技扼、PBS緩沖液或生理鹽水清洗2-3遍（也可以根據(jù)自己組織的情況，選擇適宜培養(yǎng)基清洗嫩痰；對(duì)于腫瘤等不易沾染血液的組織也可以不清洗）剿吻。在30分鐘內(nèi)完成對(duì)樣品的初步處理后，置于5 mL的組織保存液（美天旎）串纺，組織需要完全浸沒于組織保存液中丽旅。保存液需提前置于4℃中預(yù)冷。
新鮮血液：取至少3mL體積的樣品量纺棺，迅速置于EDTA抗凝管中4℃保存榄笙。
消化細(xì)胞懸液、細(xì)胞系：取至少5×105個(gè)細(xì)胞（可根據(jù)細(xì)胞濃度計(jì)算）祷蝌，取后置于已提前4℃預(yù)冷含10%血清的PBS緩沖液中办斑，4℃保存。
樣品寄送
冰上（保持低溫運(yùn)輸 4℃-16℃）快遞至百奧智匯。
注意事項(xiàng)
?組織不應(yīng)直接置于液氮中乡翅，因?yàn)闇夭羁赡軐?dǎo)致組織表面沸騰，導(dǎo)致鼓泡和不均勻凍結(jié)罪郊。這可能會(huì)造成組織破裂和形態(tài)損傷蠕蚜。
?可用錫箔紙包裹組織放入冷凍瓶，并放入棉花填充瓶子空隙以防止運(yùn)輸過程中的震動(dòng)造成樣本損壞悔橄，注意棉花填充適量靶累，不要擠壓到樣本。
?為了防止組織樣本的蒸發(fā)和脫水癣疟，速凍組織樣本必須儲(chǔ)存在密封的容器中挣柬。
參考文獻(xiàn)：
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