隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展法梯，各種多組學(xué)技術(shù)都被逐漸引入到這一大家庭中來梯刚。上一期我們給大家介紹了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+表面蛋白測序技術(shù)勺远，本期我們將聚焦另一種多組學(xué)技術(shù)——單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+染色質(zhì)可及性測序。
染色質(zhì)可及性(Chromatin accessibility)是指核大分子能夠與染色質(zhì)化的DNA進(jìn)行物理接觸的程度雁佳，由核小體及其他阻礙接近DNA的染色質(zhì)結(jié)合因子的占據(jù)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)所決定涨享。這恰好屬于近年來一大研究熱點(diǎn)——表觀遺傳學(xué)的范疇筋搏。表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)的可遺傳的變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科厕隧，其中很重要的一種就是染色質(zhì)的構(gòu)象變化引起的基因表達(dá)調(diào)控奔脐。隨著該領(lǐng)域進(jìn)展俄周，與表觀遺傳調(diào)控相關(guān)的研究迅速增長。表觀遺傳調(diào)控已成為研究很多生物學(xué)現(xiàn)象及其背后機(jī)制必不可少的一環(huán)髓迎。
接下來栈源，本文將從技術(shù)概況、核心原理&實(shí)驗(yàn)流程竖般、數(shù)據(jù)分析策略、應(yīng)用領(lǐng)域及案例茶鹃、樣本準(zhǔn)備及運(yùn)輸注意事項(xiàng)等方面涣雕，為您詳細(xì)介紹和解析這種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+染色質(zhì)可及性測序多組學(xué)技術(shù)。
技術(shù)概況
什么是scATAC-seq + scRNA-seq多組學(xué)技術(shù)闭翩？
真核生物的染色體由組蛋白和DNA組成挣郭，由DNA進(jìn)一步纏繞形成高度螺旋的凝縮結(jié)構(gòu)。而這種高度螺旋的凝縮構(gòu)象變化又可以通過表觀遺傳在染色質(zhì)水平上進(jìn)行調(diào)控疗韵，例如組蛋白的乙醵艺希化導(dǎo)致的染色質(zhì)局部的松弛而讓RNA聚合酶II能順利結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、DNA的甲基化導(dǎo)致原本呈松弛的DNA構(gòu)象變得濃縮蕉汪，使染色質(zhì)形成一個(gè)“緊密”的結(jié)構(gòu)流译，讓目的基因的轉(zhuǎn)錄無法有效進(jìn)行。因此者疤，染色質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的“開放”程度就代表了其可及性的高低福澡。
2013年，來自斯坦福大學(xué)的William Greenleaf教授在Nature Methods發(fā)表題目“Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position”的論文驹马，提出一種能夠檢測染色質(zhì)可及性的技術(shù)——ATAC-seq革砸，全稱為“Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing”，即基于高通量測序?qū)θ旧|(zhì)可及性進(jìn)行檢測糯累。
2018年底算利，10x Genomics公司推出了商業(yè)化的scATAC-seq技術(shù)產(chǎn)品，在ATAC-seq的基礎(chǔ)上加入單細(xì)胞分離步驟泳姐，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平上的染色質(zhì)可及性檢測效拭，進(jìn)一步促進(jìn)了ATAC-seq在科研領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用。
目前胖秒，該技術(shù)的最新版本已實(shí)現(xiàn)了染色質(zhì)可及性與轉(zhuǎn)錄組的共同檢測允耿，提供一種能夠?qū)渭?xì)胞表觀信息與轉(zhuǎn)錄組信息聯(lián)合起來的方法，從而允許研究者在單細(xì)胞水平揭示細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)可及性差異扒怖、鑒定細(xì)胞類型特異的轉(zhuǎn)錄因子较锡、深入研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，推測染色質(zhì)調(diào)控活性等盗痒。
核心原理&實(shí)驗(yàn)流程
scATAC-seq + scRNA-seq是如何在單細(xì)胞維度上聯(lián)合表觀與轉(zhuǎn)錄組信息的蚂蕴？
在10x Genomics的scATAC-seq + scRNA-seq的多組學(xué)技術(shù)中低散，之所以能夠?qū)崿F(xiàn)我們對同一細(xì)胞核的染色質(zhì)可及性與轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行同時(shí)分析的目的，其優(yōu)勢是在于Tn5轉(zhuǎn)座酶的特性骡楼，以獲取“開放”的染色質(zhì)DNA片段熔号，以及10x Genomics的微流控平臺，以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的區(qū)分與標(biāo)記鸟整∫鳎基于這兩大核心原理，再進(jìn)行進(jìn)一步的測序與分析篮条，我們就能夠獲得針對同一細(xì)胞的表觀組與轉(zhuǎn)錄組信息弟头，對單細(xì)胞染色質(zhì)構(gòu)象的變化、單細(xì)胞的選擇表達(dá)性進(jìn)行深層次的探究涉茧。
該技術(shù)的基本實(shí)驗(yàn)流程包括：單細(xì)胞懸液制備赴恨，轉(zhuǎn)座酶切割，細(xì)胞加條碼與文庫構(gòu)建伴栓，高通量測序以及數(shù)據(jù)分析及可視化伦连。具體過程為：首先將樣本（組織或細(xì)胞）進(jìn)行細(xì)胞核提取，得到背景干凈和結(jié)構(gòu)完整的單細(xì)胞核懸浮液后加入Tn5轉(zhuǎn)座酶對染色質(zhì)開放區(qū)域進(jìn)行剪切以獲得片段化的DNA钳垮，同時(shí)在DNA片段的末端添加測序引物惑淳；其次將帶有條碼的凝膠珠和單個(gè)細(xì)胞包裹在油滴中形成GEMs，凝膠珠在油滴內(nèi)溶解后能夠與細(xì)胞核裂解釋放的DNA+RNA結(jié)合完成單細(xì)胞標(biāo)記饺窿。凝膠珠中分別具有兩種接頭序列用汛聚，其一可利用Ploy（dT）來捕獲細(xì)胞中的mRNA，UMI用作區(qū)分同一細(xì)胞中不同的mRNA短荐，10x Barcode用作區(qū)分不同的單細(xì)胞倚舀，read 1用作后續(xù)的測序；其二在于連接從染色質(zhì)中釋放出來的DNA片段忍宋，并且同樣基于10x Barcode來區(qū)分不同單細(xì)胞的DNA片段以及后續(xù)的DNA文庫擴(kuò)增接頭序列痕貌。在凝膠珠中完成DNA與mRNA的標(biāo)記后，即可通過PCR擴(kuò)增等方法完成轉(zhuǎn)錄組+ ATAC文庫的構(gòu)建糠排《娉恚總的來說，兩種關(guān)鍵的接頭序列最終實(shí)現(xiàn)了對同一細(xì)胞中DNA和RNA的捕獲入宦。
數(shù)據(jù)分析策略
如何對scATAC-seq與scRNA-seq多組學(xué)技術(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析哺徊？
scATAC-seq與scRNA-seq多組學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)包含兩類，即ATAC數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)乾闰。對于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)落追，百奧智匯可提供多種規(guī)格的深度分析服務(wù)，詳情可見公號相關(guān)文章涯肩。對于ATAC數(shù)據(jù)轿钠，百奧智匯能夠根據(jù)基因啟動子的區(qū)間開放程度巢钓，將單細(xì)胞染色體開放區(qū)域數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)化的類單細(xì)胞表達(dá)矩陣，然后用標(biāo)準(zhǔn)化矩陣進(jìn)行聚類與降維疗垛，生成基于ATAC數(shù)據(jù)的可視化結(jié)果（t-SNE症汹、UMAP等多種算法），并根據(jù)該結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞類型注釋贷腕。同時(shí)背镇，我們還能夠比較細(xì)胞類型之間的差異富集區(qū)域，揭示細(xì)胞類型特異開放的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域泽裳。除了對兩種數(shù)據(jù)的單獨(dú)分析外瞒斩，百奧智匯還支持對兩種數(shù)據(jù)的整合分析，例如基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)獲得的分群注釋結(jié)果诡壁，解析特異性細(xì)胞類群特定基因的染色質(zhì)開放性情況，并與對應(yīng)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合解讀荠割。
應(yīng)用領(lǐng)域
腫瘤免疫調(diào)控與發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域
應(yīng)用實(shí)例：
腫瘤微環(huán)境的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)探究
如前文所介紹妹卿，scATAC-seq與scRNA-seq多組學(xué)聯(lián)用，可以將細(xì)胞的染色質(zhì)水平信息與基因表達(dá)信息結(jié)合起來蔑鹦，實(shí)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控的分析與探究夺克。2019年，來自斯坦福大學(xué)藥學(xué)院的William J. Greenleaf教授團(tuán)隊(duì)就基于scATAC-seq與scRNA-seq多組學(xué)的應(yīng)用嚎朽，在Nature Biotechnology上發(fā)表了以“Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion”為題的研究性論文铺纽。
在該研究中，作者通過系統(tǒng)地對兩種不同生物學(xué)背景下的原代細(xì)胞進(jìn)行了scATAC-seq來對基底細(xì)胞癌（BCC）腫瘤微環(huán)境中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了表觀遺傳學(xué)的探究哟忍。在該研究中狡门，作者首先繪制了健康人的骨髓和血液樣本中血液形成的單細(xì)胞染色質(zhì)及可及性分布圖，揭示了祖細(xì)胞的染色質(zhì)狀態(tài)及其分化為效應(yīng)細(xì)胞類型的調(diào)控軌跡锅很。其次其馏，作者對在接受了PD-1阻斷劑的基底細(xì)胞癌患者的原發(fā)性腫瘤活檢中進(jìn)行了scATAC-seq，探索了治療響應(yīng)的T細(xì)胞亞群的染色質(zhì)調(diào)控因子爆安，以及控制腫瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞耗竭和CD4+ T濾泡輔助細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控程序叛复。
總之，該研究利用10x Genomics的scATAC-seq技術(shù)對人體血液細(xì)胞和基底細(xì)胞癌進(jìn)行了分析扔仓，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可以識別細(xì)胞類型特異性的順式和反式調(diào)節(jié)元件褐奥，刻畫疾病相關(guān)增強(qiáng)子活性，重構(gòu)從祖細(xì)胞開始的分化軌跡翘簇。在基底細(xì)胞癌中揭示了腫瘤微環(huán)境中惡性細(xì)胞撬码、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并揭示了T細(xì)胞耗竭機(jī)制版保。此外耍群，作者還通過對PD-1單抗阻斷前后一系列腫瘤組織的分析义桂，揭示了控制腫瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞耗竭和CD4+ T濾泡輔助細(xì)胞的調(diào)控程序，從而對PD-1阻斷治療基底細(xì)胞癌無效的機(jī)制提供了解釋蹈垢。
樣本準(zhǔn)備及運(yùn)輸注意事項(xiàng)
如何準(zhǔn)備一個(gè)合格的scATAC-seq + scRNA-seq的多組學(xué)檢測樣本慷吊？
目前，百奧智匯可承接基于10x Genomics的scATAC-seq + scRNA-seq的多組學(xué)檢測分析項(xiàng)目曹抬，支持多種類型的組織溉瓶，包括組織樣本、血液樣本和細(xì)胞樣本谤民。良好的樣本準(zhǔn)備流程及運(yùn)輸過程對該實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要堰酿，因此我們總結(jié)了一些樣本準(zhǔn)備流程和運(yùn)輸注意事項(xiàng)，希望能夠?qū)Υ蠹业恼n題研究提供幫助张足。
組織触创、血液及細(xì)胞等新鮮樣品的樣品準(zhǔn)備
?新鮮組織：取至少250 mm3體積的樣品量，使用1640培養(yǎng)基为牍、PBS緩沖液或生理鹽水清洗2-3遍（客戶也可以根據(jù)自己組織的情況哼绑，選擇適宜培養(yǎng)基清洗；對于腫瘤等不易沾染血液的組織也可以不清洗）碉咆。在30分鐘內(nèi)完成對樣品的初步處理后抖韩，置于5 mL的組織保存液（美天旎），組織需要完全浸沒于組織保存液中疫铜。保存液需提前置于4℃中預(yù)冷茂浮。
?新鮮血液：取至少3mL體積的樣品量，迅速置于EDTA抗凝管中4℃保存壳咕。
?消化細(xì)胞懸液席揽、細(xì)胞系：取至少5×105個(gè)細(xì)胞（可根據(jù)細(xì)胞濃度計(jì)算），取后置于已提前4℃預(yù)冷含10%血清的PBS緩沖液中谓厘，4℃保存驹尼。
樣品寄送
冰上（保持低溫運(yùn)輸 4℃-16℃）快遞至百奧智匯。
參考文獻(xiàn)：
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