A gene expression assay based on chronic lymphocytic leukemia activation in the microenvironment to predict progression
基于微環(huán)境中慢性淋巴細(xì)胞白血病激活的基因表達(dá)檢測(cè)預(yù)測(cè)病情發(fā)展
發(fā)表期刊：Blood Adv
發(fā)表日期：2022 Nov 8
影響因子：7.637
DOI:? 10.1182/bloodadvances.2022007508
一西轩、研究背景
????????人們普遍認(rèn)為近忙，無(wú)癥狀且處于早期臨床階段的慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）患者不需要治療。然而枯饿，關(guān)于克隆演變風(fēng)險(xiǎn)的累積數(shù)據(jù)重新激發(fā)了對(duì)可能迅速進(jìn)展的診斷患者進(jìn)行早期治療的興趣北发。在這種情況下的預(yù)后昂勒，通常依賴于大量的實(shí)驗(yàn)室數(shù)值恬汁、細(xì)胞遺傳學(xué)異常皆警、基因突變或IGHV基因的突變狀態(tài)苏研。
????????基因表達(dá)譜和CLL患者的臨床過(guò)程在各種研究中都有關(guān)聯(lián)。然而基于基因表達(dá)譜的生物標(biāo)志物有幾個(gè)注意事項(xiàng)脊另，使其不能廣泛應(yīng)用于CLL患者的預(yù)后济赎。這些問(wèn)題包括缺乏可重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)化鉴逞，以及生物信息學(xué)分析的復(fù)雜性。重要的是司训，聚類方法的預(yù)后價(jià)值受到限制构捡，因?yàn)楫?dāng)不同的病人被納入聚類過(guò)程時(shí)，個(gè)體的分配可能會(huì)有所不同壳猜，從而阻礙了這些方法的實(shí)時(shí)使用勾徽。
二、材料與方法
1蓖谢、數(shù)據(jù)來(lái)源
1） 訓(xùn)練隊(duì)列捂蕴，使用了156個(gè)未經(jīng)治療的樣本譬涡，其中119個(gè)來(lái)自Vall d'Hebron大學(xué)醫(yī)院闪幽，37個(gè)來(lái)自薩拉曼卡大學(xué)
2） 使用來(lái)自德國(guó)海德堡德國(guó)癌癥研究中心的一個(gè)獨(dú)立患者隊(duì)列的112個(gè)樣本對(duì)該檢測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證
2啥辨、分析流程
1） 基因表達(dá)分析：在NanoString平臺(tái)上，使用nCounter PrepStation的 "高靈敏度 "設(shè)置和nCounter數(shù)字分析儀的555視野盯腌，對(duì)250納克RNA的基因表達(dá)進(jìn)行了量化
2） 基因選擇和模型建立的描述：從文獻(xiàn)中選擇的基因包括與慢性淋巴細(xì)胞白血哺戎（CLL）細(xì)胞在微環(huán)境中的激活有關(guān)的基因，特別是那些在淋巴結(jié)和BCR刺激后的CLL細(xì)胞中差異表達(dá)的基因腕够，CLL進(jìn)展中細(xì)胞過(guò)程和相關(guān)途徑的代表基因级乍，以及其他對(duì)CLL有潛在預(yù)后意義的基因，如根據(jù)IGHV突變狀態(tài)差異表達(dá)的基因帚湘；還包括一組特定的管家基因玫荣，用于對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行逐個(gè)樣本的標(biāo)準(zhǔn)化處理；對(duì)每個(gè)內(nèi)源性基因進(jìn)行了單變量Cox模型調(diào)整大诸；使用22個(gè)管家基因的幾何平均值進(jìn)行RNA負(fù)載的歸一化捅厂；在進(jìn)一步的分析中，排除了那些表達(dá)水平達(dá)到或接近背景水平的基因资柔，應(yīng)用彈性網(wǎng)方法的回歸懲罰模型被用來(lái)選擇那些對(duì)解釋首次治療時(shí)間（TtFT）變量貢獻(xiàn)最大的基因焙贷，最終選擇了15個(gè)基因；在分析的22個(gè)看家基因中贿堰，也選擇了15個(gè)看家基因辙芍，基于不同樣本的低變異性，并在最終模型中用于歸一化
3） 預(yù)測(cè)性基因表達(dá)得分：利用訓(xùn)練隊(duì)列中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)羹与，使用懲罰性的Cox模型故硅，為首次治療時(shí)間（TtFT）制作一個(gè)簡(jiǎn)明的預(yù)測(cè)模型；為了評(píng)估從所選基因得到的多變量Cox模型的整體性能纵搁，計(jì)算了不同的診斷參數(shù)
三契吉、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
01 - 基于基因表達(dá)的預(yù)后模型的產(chǎn)生：CLL15測(cè)定
????????訓(xùn)練隊(duì)列由156名先前未經(jīng)治療的CLL患者組成。該系列的中位年齡為66歲诡渴，57%的患者是男性捐晶。，37%的樣本是在CLL診斷時(shí)獲得的妄辩，而63%的樣本是在任何CLL治療前的患者隨訪中獲得的惑灵。從CLL診斷到樣本采集的中位時(shí)間為11.9個(gè)月。對(duì)TtFT的分析是從收集樣本的日期到治療開(kāi)始的日期計(jì)算眼耀。92例（59%）為IGHV突變英支，54例（35%）為IGHV未突變，9例（6%）因多克隆哮伟、非生產(chǎn)性或雙克隆重排而未確定干花。在1個(gè)病例中妄帘，沒(méi)有獲得IGHV突變的數(shù)據(jù)。
????????在訓(xùn)練隊(duì)列的156個(gè)樣本中池凄，確定了178個(gè)感興趣的基因和22個(gè)管家基因的數(shù)字基因表達(dá)抡驼。在154個(gè)（99%）樣本中獲得了足夠的基因表達(dá)。排除了兩個(gè)質(zhì)量不足以進(jìn)行表達(dá)測(cè)試的樣本（1%）肿仑。
????????在單變量Cox回歸分析中致盟，76個(gè)基因的表達(dá)與TtFT明顯相關(guān)（FDR<0.05），88個(gè)基因的FDR<0.1尤慰。共有46個(gè)基因（FDR<0.1）符合預(yù)先指定的納入標(biāo)準(zhǔn)馏锡，并被選作進(jìn)一步分析。其中伟端，共有15個(gè)基因（MYC杯道、ITGA4、CERS6责蝠、ZNF471党巾、ZNF667、SEPT10P1玛歌、ZAP70昧港、LTK、CCL3支子、CNR1创肥、EGR2、TNF值朋、IL4R叹侄、FGL2、PPBP）被最終選定為使用懲罰性Cox方法建立TtFT的預(yù)后模型昨登。此外趾代，根據(jù)其在樣本中的低變異性，選擇了15個(gè)管家基因丰辣。利用15個(gè)預(yù)測(cè)基因的表達(dá)量與15個(gè)看家基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化撒强，建立了一個(gè)最終模型，命名為CLL15笙什，以預(yù)測(cè)訓(xùn)練隊(duì)列中的TtFT（圖1）飘哨。
????????隨后，建立了一個(gè)線性方程琐凭，包括15個(gè)基因的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換芽隆、歸一化的基因表達(dá)水平乘以各自的回歸系數(shù)，并對(duì)訓(xùn)練隊(duì)列中的每個(gè)病人進(jìn)行計(jì)算，以獲得CLL15評(píng)分胚吁。該模型的C統(tǒng)計(jì)量為0.77牙躺。圖2A顯示了放寬連續(xù)變量的線性假設(shè)后CLL15評(píng)分與TtFT風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)形狀。作為一個(gè)連續(xù)變量腕扶，CLL15檢測(cè)得分與TtFT相關(guān)孽拷。為了更好地對(duì)進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分層，使用R partykit軟件包確定了定義3個(gè)具有差異化結(jié)果（TtFT）的最佳閾值蕉毯。低風(fēng)險(xiǎn)組（得分≤2.718乓搬，占隊(duì)列的55%）的5年開(kāi)始治療的估計(jì)風(fēng)險(xiǎn)為30.5%思犁。在中危組（得分≤3.535和>2.718代虾，占隊(duì)列的20%），5年的估計(jì)治療風(fēng)險(xiǎn)為57.8%激蹲。最后棉磨，在高風(fēng)險(xiǎn)組（得分>3.535，占隊(duì)列的25%）中学辱，5年開(kāi)始治療的估計(jì)風(fēng)險(xiǎn)是93.4%（圖2B）乘瓤。值得注意的是，CLL15評(píng)分在早期臨床階段的患者亞組（n = 116）中表現(xiàn)出類似的預(yù)后能力策泣，低衙傀、中、高風(fēng)險(xiǎn)組的5年估計(jì)治療開(kāi)始風(fēng)險(xiǎn)分別為18.2%萨咕、44.8%和79.54%（圖2C）统抬。
02 - CLL15評(píng)分的預(yù)后價(jià)值與IGHV突變狀態(tài)和IPS-E CLL無(wú)關(guān)
????????本研究分析了CLL15檢測(cè)獲得的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)組與CLL中已知的生物預(yù)后因素之間的關(guān)系，包括FISH確定的最常見(jiàn)的染色體改變（del17p危队、del11q和12三體）聪建，流式細(xì)胞儀確定的ZAP-70和CD38的蛋白表達(dá)水平，TP53茫陆、NOTCH1金麸、SF3B1和MYD88基因的突變，IGHV的突變狀態(tài)簿盅，CLL-IPI挥下，以及IPS-E CLL評(píng)分。在單變量分析中桨醋，一些因素棚瘟，如SF3B1突變、IGHV狀態(tài)讨盒、流式細(xì)胞術(shù)中ZAP-70和CD38的表達(dá)解取、臨床分期（RAI和Binet）、CLL-IPI和IPS-E評(píng)分與TtFT有關(guān)（圖3）返顺。在最后的多變量分析中禀苦，CLL15評(píng)分蔓肯、IPS-E CLL和Binet分期是唯一保持其獨(dú)立統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素（圖3）。
????????作者隨后探索了將IGHV的突變狀態(tài)（突變/未突變）作為一個(gè)變量引入到表達(dá)模型中振乏，并將其性能與之前僅有基因表達(dá)的模型進(jìn)行比較蔗包。綜合模型的C統(tǒng)計(jì)量為0.79，偏差分析顯示慧邮，將IGHV狀態(tài)加入到基因表達(dá)分?jǐn)?shù)中（反之亦然）提供了重要的預(yù)測(cè)信息调限。根據(jù)這些結(jié)果，結(jié)合基因表達(dá)與IGHV變量的模型在預(yù)測(cè)TtFT方面比基因表達(dá)和IGHV本身的模型表現(xiàn)更好误澳。在成對(duì)的多變量Cox模型中耻矮，兩個(gè)變量、IGHV突變狀態(tài)和根據(jù)基因表達(dá)模型分類的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)組都對(duì)預(yù)后有貢獻(xiàn)（圖2D）忆谓。
????????納入CLL15評(píng)分也提高了IPS-E評(píng)分預(yù)測(cè)TtFT的能力裆装。圖4A顯示，當(dāng)CLL15評(píng)分與IPS-E評(píng)分或IGHV狀態(tài)同時(shí)被納入模型時(shí)倡缠，以C統(tǒng)計(jì)量計(jì)算的鑒別能力有所提高哨免。此外，在成對(duì)的多變量Cox模型中昙沦，CLL-IPI和CLL15對(duì)訓(xùn)練隊(duì)列中的TtFT也有獨(dú)立貢獻(xiàn)琢唾，單獨(dú)的CLL-IPI的C統(tǒng)計(jì)量為0.73，組合的C統(tǒng)計(jì)量為0.81盾饮。然而采桃，當(dāng)包括IPS-E評(píng)分時(shí)，CLL-IPI的信息并沒(méi)有改善模型丐谋。最后芍碧，CLL15評(píng)分，IGHV狀態(tài)号俐，和IPS-E評(píng)分都是改善TtFT預(yù)測(cè)的獨(dú)立因素（圖4B）泌豆。
03 - CLL15檢測(cè)方法的驗(yàn)證和重現(xiàn)性
????????隨后吏饿，CLL15檢測(cè)方法在來(lái)自海德堡獨(dú)立隊(duì)列的112名患者的低溫保存樣本中得到驗(yàn)證踪危。作為一個(gè)連續(xù)變量，CLL15評(píng)分與TtFT明顯相關(guān)猪落。圖5A顯示了驗(yàn)證隊(duì)列中放寬線性假設(shè)后CLL15評(píng)分與TtFT風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)贞远。使用訓(xùn)練隊(duì)列中預(yù)先確定的截止點(diǎn)，該檢測(cè)方法將22名（19.6%）患者分配到低風(fēng)險(xiǎn)組笨忌，42名（37.5%）分配到中度風(fēng)險(xiǎn)組蓝仲，48名（42.9%）分配到高風(fēng)險(xiǎn)組。這3組呈現(xiàn)出不同的結(jié)果，低袱结、中亮隙、高風(fēng)險(xiǎn)組60個(gè)月的估計(jì)治療風(fēng)險(xiǎn)分別為16.5%、40%和58.1%（圖5B）垢夹。
????????此外溢吻，正如在訓(xùn)練隊(duì)列中觀察到的，基因表達(dá)信息果元，無(wú)論是作為連續(xù)變量還是作為風(fēng)險(xiǎn)組促王，都是存在IGHV突變狀態(tài)的獨(dú)立預(yù)后因素。IGHV突變狀態(tài)和基因表達(dá)模型的C統(tǒng)計(jì)量分別為0.6和0.63而晒，而綜合模型的C統(tǒng)計(jì)量為0.67蝇狼。正如在訓(xùn)練隊(duì)列中觀察到的，通過(guò)結(jié)合CLL15評(píng)分和IGHV突變狀態(tài)信息欣硼，確定了3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組（補(bǔ)充圖3）题翰。為了確定CLL15檢測(cè)的可重復(fù)性恶阴，選擇了9個(gè)樣品诈胜，其分?jǐn)?shù)分布在整個(gè)檢測(cè)中（低風(fēng)險(xiǎn)、中度風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)）冯事。將每個(gè)樣本的RNA在CLL15檢測(cè)中運(yùn)行焦匈，一式三份，每份在不同的NanoString試劑盒上運(yùn)行昵仅。結(jié)果顯示缓熟，三份樣本的風(fēng)險(xiǎn)組分配100%一致，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.073分摔笤。
四够滑、結(jié)論
?????????CLL的生物學(xué)預(yù)后依賴于基因畸變和IGHV的突變狀態(tài)的使用。不幸的是吕世，基因表達(dá)譜的使用由于其技術(shù)上的困難和可重復(fù)性而一直很困難彰触，排除了其在臨床實(shí)踐中的使用。使用較新的命辖、可重復(fù)性更高的方法來(lái)評(píng)估基因表達(dá)况毅，可以完善已確立的預(yù)后參數(shù)，評(píng)估CLL患者預(yù)后的整個(gè)生物學(xué)特征尔艇。本文介紹的研究成功地將以前描述的具有強(qiáng)大預(yù)后價(jià)值的基因表達(dá)特征轉(zhuǎn)化為一種新的基于基因表達(dá)的檢測(cè)方法尔许，即CLL15，適用于常規(guī)診斷環(huán)境终娃。
