A Novel Lactate Metabolism-Related Gene Signature for Predicting Clinical Outcome and Tumor Microenvironment in Hepatocellular Carcinoma
預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌臨床結(jié)果和腫瘤微環(huán)境的新型乳酸代謝相關(guān)基因特征
發(fā)表期刊：Front Cell Dev Biol
發(fā)表日期：2022 Jan 3
doi:2022 Jan 3
一叹洲、背景
????????肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型碍讯，是全球癌癥死亡的第三大原因峡懈。然而在岂，晚期肝細(xì)胞癌的治療結(jié)果仍然不令人滿意患民，即使在成功根除腫瘤后，肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)率也非常高弓柱。腫瘤細(xì)胞的代謝改變不僅有利于細(xì)胞增殖鼠哥，而且通過(guò)釋放代謝物，特別是乳酸露久，對(duì)抗腫瘤免疫有深刻的影響更米。因此，確定代謝相關(guān)特征以評(píng)估TME和提高免疫治療的治療效果至關(guān)重要抱环。
????????與正常細(xì)胞不同壳快，即使在充足的氧氣條件下纸巷，腫瘤細(xì)胞也會(huì)代謝葡萄糖镇草，產(chǎn)生乳酸。乳酸鹽的積累提供了一個(gè)酸性的微環(huán)境瘤旨，有利于腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展梯啤。此外，有氧糖酵解產(chǎn)生的乳酸可以作為一種信號(hào)分子分泌到細(xì)胞外環(huán)境中存哲，以調(diào)節(jié)細(xì)胞間的相互作用因宇。鑒于乳酸在腫瘤發(fā)生和免疫抑制TME中的重要作用，針對(duì)其代謝有望成為癌癥治療的有效手段祟偷。
二察滑、材料與方法
1.數(shù)據(jù)來(lái)源
(1)TCGA-HCC隊(duì)列作為訓(xùn)練集
(2)從ICGC網(wǎng)站下載一個(gè)獨(dú)立的HCC數(shù)據(jù)集，ICGC-LIRI-JP隊(duì)列作為驗(yàn)證集
(3)從MolecularSignatures數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到289個(gè)LMRG修肠；從Cistrome下載與癌癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子
2.實(shí)驗(yàn)流程
(1)差異表達(dá)的LMRG和轉(zhuǎn)錄因子：在TCGA-HCC隊(duì)列的50個(gè)正常組織和374個(gè)腫瘤組織之間進(jìn)行了差異表達(dá)分析贺辰；使用R中的 "clusterprofiler "包進(jìn)行GO和KEGG富集分析
(2)LMRGS的構(gòu)建和評(píng)估：對(duì)差異表達(dá)的LMRGs進(jìn)行單變量Cox回歸分析，以確定具有預(yù)后價(jià)值的LMRGs；使用 "glmnet "軟件包進(jìn)一步進(jìn)行了LASSO Cox回歸饲化；通過(guò)LASSO回歸篩選后莽鸭，選定的LMRGs被應(yīng)用于通過(guò)多變量Cox回歸分析建立LMRGS；主成分分析（PCA）被用來(lái)評(píng)估該特征的分類準(zhǔn)確性吃靠；生存分析硫眨；應(yīng)用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型來(lái)確定LMRGS作為OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素
(3)建立nomogram：為了預(yù)測(cè)HCC患者的1、3巢块、5年生存率礁阁，根據(jù)LMRGS和重要的臨床病理參數(shù)構(gòu)建了nomogram
(4)TMB的計(jì)算：為了計(jì)算每個(gè)HCC腫瘤樣本的TMB，我們選擇了TCGA-HCC隊(duì)列中由VarScan平臺(tái)處理的體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)
(5)不同LMRGS亞群中TME的綜合分析：ESTIMATE族奢、ssGSEA氮兵、CIBERSORT
(6)基因富集分析：GSEA
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.LMRG的鑒定
????????通過(guò)差異基因篩選分析歹鱼，作者得到了66個(gè)差異表達(dá)的LMRG泣栈，包括3個(gè)下調(diào)基因和63個(gè)上調(diào)基因。熱圖顯示了LMRGs在HCC樣本和正常樣本中的表達(dá)（圖1A）弥姻，下調(diào)和上調(diào)的LMRGs的差異性表達(dá)表現(xiàn)在火山圖上（圖1B）南片。通過(guò)功能富集分析對(duì)66個(gè)差異表達(dá)的LMRG進(jìn)行了進(jìn)一步分析。LMRGs的主要生物過(guò)程（BP）為參與線粒體基因組維持庭敦、線粒體呼吸鏈復(fù)合體組裝疼进、電子傳遞鏈和代謝過(guò)程。對(duì)于細(xì)胞成分（CC）秧廉，LMRGs主要存在于線粒體內(nèi)膜伞广、呼吸鏈復(fù)合體和線粒體呼吸體。LMRGs的分子功能（MF）主要富集在電子傳遞活性疼电、NADH脫氫酶活性和氧化還原酶活性（圖1C）嚼锄。信號(hào)通路分析表明，差異表達(dá)的LMRGs與產(chǎn)熱蔽豺、糖尿病性心肌病区丑、氧化磷酸化、非酒精性脂肪肝和活性氧有關(guān)（圖1D）修陡。上述結(jié)果表明沧侥，LMRGs主要與代謝過(guò)程和氧化反應(yīng)有關(guān)。
2.LMRGS的發(fā)現(xiàn)與預(yù)后意義
????????為了確定與OS相關(guān)的LMRGs魄鸦，作者進(jìn)行了單變量的Cox回歸分析宴杀。共有29個(gè)LMRGS與預(yù)后有關(guān)（圖2A）。經(jīng)過(guò)LASSO回歸選擇后拾因，只有10個(gè)LMRGs旺罢。然后多變量Cox回歸分析構(gòu)建了LMRGS（圖2B,C）斯棒。根據(jù)LMRGS的系數(shù)和參與LMRGS的6個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)（包括FKTN，PDSS1主经，PET117荣暮，PUS1，RARS1和RNASEH1）計(jì)算了LMRGS得分（圖2D）罩驻。每個(gè)HCC患者的LMRGS得分如下穗酥。LMRGS得分=FKTN表達(dá)量×0.2496 + PDSS1表達(dá)量×0.0881 + PET117表達(dá)量×0.0648 + PUS1表達(dá)量×0.0567 + RARS1表達(dá)量×0.0362 + RNASEH1表達(dá)量×0.0928。
????????以LMRGS得分的中位數(shù)為界限惠遏，將HCC患者分為兩個(gè)亞組砾跃。LMRGS-高組和LMRGS-低組（圖3A）。熱圖顯示了兩個(gè)LMRGS亞組中六個(gè)關(guān)鍵基因的不同表達(dá)（圖3B）节吮。圖3C顯示了每個(gè)HCC患者的LMRGS評(píng)分和生存狀況抽高。KM分析表明，LMRGS高分的患者的生存期比LMRGS低分的患者有更短（圖3D）透绩。如圖3E所示翘骂，在TCGA隊(duì)列中，1年帚豪、3年和5年的ROC分析的AUC值分別為0.768碳竟、0.691和0.666。此外狸臣，單變量和多變量回歸分析表明莹桅，LMRGS評(píng)分是OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在TCGA隊(duì)列中烛亦，LMRGS評(píng)分和臨床病理因素的相關(guān)性得到了闡明诈泼。結(jié)果表明，LMRGS評(píng)分與病理分級(jí)煤禽、臨床分期铐达、血管侵襲和病毒感染密切相關(guān)（圖S2）。上述結(jié)果表明呜师，LMRGS評(píng)分在HCC的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用娶桦。
3.預(yù)測(cè)OS的nomogram
????????為了準(zhǔn)確預(yù)測(cè)OS的概率贾节，作者建立了一個(gè)綜合LMRGS評(píng)分和其他臨床病理特征的nomogram汁汗，包括年齡、性別和TNM分期（圖4A）栗涂，可以根據(jù)總分來(lái)估計(jì)1年知牌、3年和5年的生存率。校準(zhǔn)曲線表明斤程，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值高度一致（圖4B）角寸。與時(shí)間相關(guān)的ROC曲線也表明菩混，該nomogram對(duì)預(yù)測(cè)生存率有很高的準(zhǔn)確性（圖4C）。
4.轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)
????????LMRGs和轉(zhuǎn)錄因子之間存在著密切的相互作用扁藕。為了探索這種關(guān)系沮峡，作者進(jìn)行了共表達(dá)分析。如圖5A所示亿柑，確定了52個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子與六個(gè)重要的LMRG共表達(dá)邢疙。共表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子主要功能是染色質(zhì)重塑和組蛋白修飾（圖5B）。KEGG分析顯示望薄，這些轉(zhuǎn)錄因子主要參與了細(xì)胞周期疟游、細(xì)胞衰老和Hippo信號(hào)傳導(dǎo)途徑（圖5C）。
5.與TMB的關(guān)聯(lián)
????????在TCGA訓(xùn)練集中痕支，作者計(jì)算了每個(gè)HCC患者的TMB颁虐。發(fā)現(xiàn)LMRGS高組的TMB較高（圖6A，B）卧须。然后對(duì)不同LMRGS亞組的突變情況通過(guò)瀑布圖進(jìn)行了可視化（圖6C）另绩。對(duì)于整個(gè)數(shù)據(jù)集，HCC的前10個(gè)突變基因是TP53花嘶、CTNNB1板熊、TTN、MUC16察绷、ALB干签、PCLO、APOB拆撼、RYR2容劳、MUC4和FLG。錯(cuò)義突變是最常見(jiàn)的體細(xì)胞突變類型闸度。在LMRGS高組中竭贩，樣本的突變頻率更高。此外莺禁，LMRGS高分的患者有較高的關(guān)鍵基因突變概率留量，尤其是TP53。隨后哟冬，進(jìn)行了KM分析以評(píng)估LMRGS評(píng)分與TMB結(jié)合對(duì)生存的影響楼熄，結(jié)果顯示高TMB組的生存時(shí)間要比低TMB組短（圖6D）。更重要的是浩峡，低LMRGS評(píng)分和低TMB的患者的OS明顯長(zhǎng)于高LMRGS評(píng)分和高TMB的患者（圖6E）可岂。
????????在ICGC驗(yàn)證隊(duì)列中，還分析了所有樣本的突變情況翰灾。兩個(gè)LMRGS亞組之間不存在TMB差異（圖S3A,B）缕粹。然而稚茅，在LMRGS高組，HCC中普遍突變的基因的突變頻率更高（圖S3C）平斩。LMRGS評(píng)分與TMB相結(jié)合的生存分析結(jié)果與訓(xùn)練隊(duì)列一致（圖S3D,E）亚享。
6.不同LMRGS亞組中的TME特征
????????TME中的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的進(jìn)展、治療效果和臨床結(jié)果有深遠(yuǎn)的影響绘面。圖7A所示的熱圖顯示了所有樣本的基質(zhì)得分和免疫活性虹蒋，發(fā)現(xiàn)LMRGS-低組的基質(zhì)細(xì)胞的豐度相對(duì)較高。此外飒货，LMRGS-低組的免疫評(píng)分比LMRGS-高組高（圖7B）魄衅。如圖7C所示，LMRGS-高組和LMRGS-低組在免疫功能方面存在差異塘辅。LMRGS-低組的細(xì)胞溶解和IFN反應(yīng)的活性更高晃虫。在LMRGS-高組中，MHCⅠ類的表達(dá)較高扣墩。
????????為了全面分析免疫微環(huán)境哲银，用CIBERSORTx計(jì)算了22種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。圖8A顯示了TCGA-HCC樣本的免疫景觀呻惕。通過(guò)比較免疫細(xì)胞譜荆责，發(fā)現(xiàn)在LMRGS高組中，濾泡性輔助T細(xì)胞（Tfh）亚脆、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）和M0巨噬細(xì)胞明顯增加做院。相反，靜息NK細(xì)胞濒持、單核細(xì)胞键耕、靜息肥大細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞在LMRGS低組中浸潤(rùn)更多（圖8B）。
????????除免疫細(xì)胞外柑营，進(jìn)一步探討了免疫分子與LMRGS評(píng)分的相關(guān)性屈雄，LMRGS評(píng)分與免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)呈正相關(guān)，包括PD-1官套、CTLA4酒奶、LAG3、TIM3和TIGIT（圖9）奶赔。
7.LMRGS的GSEA
????????為了探索LMRGS所涉及的分子機(jī)制惋嚎，作者采用了GSEA來(lái)分析TCGA隊(duì)列。富集結(jié)果顯示纺阔，DNA修復(fù)瘸彤、E2F靶點(diǎn)、G2M檢查點(diǎn)笛钝、糖酵解质况、有絲分裂紡錘體、mTOR信號(hào)玻靡、MYC靶點(diǎn)和未折疊蛋白反應(yīng)被LMRGS高組激活（圖10A）结榄。此外，LMRGS還參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子囤捻、DNA修復(fù)臼朗、細(xì)胞周期和代謝相關(guān)的信號(hào)通路（圖10B）。
四蝎土、結(jié)論
? ? ? ? 本研究構(gòu)建了一個(gè)新的LMRGS视哑，對(duì)評(píng)估肝細(xì)胞癌的預(yù)后和反映TME具有較高的價(jià)值。其與臨床結(jié)局密切相關(guān)誊涯，是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)挡毅。此外，不同LMRGS評(píng)分的患者具有不同的TME狀態(tài)暴构，包括基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度跪呈，免疫活性和免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)。因此取逾，LMRGS是一種很有前途的生物標(biāo)志物耗绿，可以預(yù)測(cè)HCC中的分子和免疫特征，這可能為HCC治療提供新的治療策略砾隅。
