背景：心肌致密化不全(noncompaction of the ventricular myocardium)為一種少見但嚴(yán)重的先天性心臟畸形（發(fā)病率在心肌病中僅次于DCM和HCM）顺呕，是由于胚胎形成過程中心肌致密化過程失敗所致，其解剖學(xué)特征是心室壁過多突入心腔的肌小梁及小梁間深陷的隱窩讳癌。因其主要累及左心室负饲，也稱左室心肌致密化不全(left ventricular noncompaction，LVNC)。
臨床表現(xiàn)主要為心力衰竭添谊、心律失常及心內(nèi)膜血栓伴體循環(huán)栓塞。目前尚無特效治療察迟。本病有家族遺傳傾向斩狱，12%～50%的患者都有家族史，多數(shù)符合常染色體顯性遺傳扎瓶，但少數(shù)病例符合X染色體連鎖隱性遺傳及線粒體遺傳所踊。

在作者此前的研究中¹，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮特異性敲除染色質(zhì)重塑分子Ino80可以引起LVNC表型概荷，小鼠同時出現(xiàn)了冠脈血管生成受損和室壁致密化不全秕岛。而特異性敲除心肌或內(nèi)皮的Ino80，心室發(fā)育和致密化則不受影響。在出現(xiàn)了LVNC表型的Tie2Cre;Ino80^fl/fl乳鼠心臟继薛，作者觀察到冠脈血管新生受損修壕，這和在心內(nèi)膜和內(nèi)皮細(xì)胞中增加的E2F介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增相一致。因此作者假設(shè)當(dāng)冠脈新生不能正常發(fā)生惋增，它不能提供旁分泌或angiocrine分子來促進(jìn)心肌致密化叠殷。同時改鲫，剩余的心內(nèi)膜分泌促進(jìn)成熟和抑制心肌增殖的分子诈皿，引起心室壁的非致密化。
在這篇文章中像棘，作者使用單細(xì)胞測序?qū)ie2Cre;Ino80^fl/fl和wild type乳鼠心臟進(jìn)行了單細(xì)胞測序稽亏，鑒定出正常發(fā)育和LVNC時心內(nèi)膜和EC表達(dá)的angiocrines。作者還在小鼠心臟和人iPSC誘導(dǎo)的心肌中評估了鑒定出的分泌分子對心肌細(xì)胞增殖和成熟的調(diào)節(jié)作用缕题。

1. Altered endocardial and cardiomyocyte transcriptomes in Ino80 mutant hearts with left ventricular non-compaction

Fig 1A：作者對embryonic day E15.5的Tie2Cre;Ino80^fl/+和Tie2Cre;Ino80^fl/fl小鼠心臟進(jìn)行了10x單細(xì)胞測序截歉，后者展現(xiàn)出了LVNC表型。一共得到了518+576個細(xì)胞（10x測的細(xì)胞數(shù)這么少的烟零？）
Fig 1B-C：聚類和注釋得到9個細(xì)胞群瘪松，包括內(nèi)皮 (Npr3+), 冠脈ECs (Cldn5+,Fabp4+), 平滑肌/周皮細(xì)胞 (Pdgfrb+), 心外膜 (Apela+), 3群成纖維 (Tcf21+, Col1a1+, Vcan+), 2群心室肌 (Tnni1+, Ttn+)。所有的細(xì)胞類型在兩組樣品中都存在锨阿。
Fig 1D：隨后作者對內(nèi)皮和冠脈ECs進(jìn)行了重新聚類宵睦，得到3群心內(nèi)膜細(xì)胞和1群冠脈內(nèi)皮細(xì)胞。三群心內(nèi)膜細(xì)胞中有一群(Endo 3)只在Tie2Cre;Ino80^fl/fl小鼠心臟中存在墅诡。
Fig 1E, F：Endo 3高表達(dá)增殖基因如Top2a和Cdk1壳嚎。
Fig 1G, H：和前面E12.5的研究相一致¹，在體EDU標(biāo)記和切片顯示這些異位的增殖心內(nèi)膜細(xì)胞在E15.5時期定位在非致密化的心肌末早。
Thus, this mouse model of ventricular non-compaction is coincident with the emergence of mutant-specific proliferative endocardial cells embedded within non-compacted myocardium.

Fig 2A：由于心內(nèi)膜/內(nèi)皮Ino80敲除的表型主要在心肌烟馅，所以作者隨后對心肌進(jìn)行了重新聚類，得到3個群然磷。
Fig 2B, C：作者期望不同的心肌亞群可以代表不同的致密的和非致密的心肌郑趁。但是發(fā)現(xiàn)根據(jù)已知的致密和小梁marker不能很好的區(qū)分。細(xì)胞主要是根據(jù)成熟度和增殖區(qū)分開的姿搜。

成熟心肌marker：Ttn, Myh7, mt-Co1
immature myocardium：Tnni1
cycling：Aurka, Cdk1

Fig 2D：對兩組小鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行差異分析寡润，Ino80 缺陷小鼠的心肌細(xì)胞有39個基因下調(diào)，13個上調(diào)痪欲。富集分析結(jié)果顯示糖酵解悦穿，脂肪酸代謝等通路在Ino80 缺陷小鼠的心肌細(xì)胞中被富集到，而與myogenesis相關(guān)的通路則出現(xiàn)下調(diào)业踢。
Fig 2E, F：E圖展示了一些與前面通路有關(guān)的基因栗柒，F(xiàn)圖使用in situ hybridization驗(yàn)證了一下Nppa的表達(dá)。

2. Left ventricular non-compaction-associated genes are expressed in multiple cardiac cell types

Fig 3A：作者觀察到Tie2Cre;Ino80^fl/fl小鼠心臟存在血管細(xì)胞的先天缺陷，可以引起小鼠心室致密化不全瞬沦。為了確定這個現(xiàn)象在人類中可能也存在太伊，作者首先檢測了LVNC患者中存在變異的基因在對照小鼠中的表達(dá)。有趣的是逛钻，接近半數(shù)基因特異性的在不成熟的CM1群表達(dá)僚焦，一些基因則在成熟的CM2群表達(dá)更高。還有1/3并不在心肌表達(dá)曙痘，而是在基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)芳悲，比如內(nèi)皮，冠脈內(nèi)皮边坤，壁細(xì)胞和成纖維名扛。

為了進(jìn)一步研究這些發(fā)現(xiàn)和臨床患者的相關(guān)性，作者對一個22周的胎兒心臟進(jìn)行了單細(xì)胞測序茧痒。
Fig 3B：在Fig 3A中查看的基因在人類心臟中也存在著類似的表達(dá)模式肮韧。
Fig 3C：在另外一個成人心臟數(shù)據(jù)集中，這些基因也存在著類似的表達(dá)模式旺订。

Fig 3D：隨后作者探究了這些基因是否在Tie2Cre;Ino80^fl/+和Tie2Cre;Ino80^fl/fl小鼠心臟中存在差異弄企。在這些基因中，有7個基因至少在一個細(xì)胞類型中存在差異表達(dá)区拳。
These data indicate the possibility that LVNC-associated genes are derived from cells other than cardiomyocytes in humans and that they may be important for cardiac homeostasis and function in the adult.

3. Col15a1 is expressed in coronary ECs and stimulates cardiomyocyte proliferation

作者此前的研究顯示拘领，內(nèi)皮細(xì)胞刺激心肌細(xì)胞增殖這一對心室致密化至關(guān)重要的過程并不依賴于血流，而且是Ino80依賴的劳闹。因此作者假設(shè)這個活動是被冠脈內(nèi)皮特異性分泌的分子介導(dǎo)的院究，而且這個分子在Ino80突變后會出現(xiàn)下降。因此作者在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中篩選了1. 冠脈內(nèi)皮表達(dá); 2. 心內(nèi)膜不表達(dá); 3. 編碼分泌蛋白 的基因本涕，得到15個候選基因业汰。

Fig 4A：在候選基因中，作者發(fā)現(xiàn)Col15a1在正常小鼠冠脈內(nèi)皮菩颖、平滑肌和成纖維細(xì)胞表達(dá)样漆，在人的冠脈內(nèi)皮和成纖維表達(dá)。
Fig 4A-C：但是在Ino80缺陷冠脈EC中晦闰，Col15a1的表達(dá)顯著下降放祟。（其他細(xì)胞類型沒有出現(xiàn)明顯下降）
Fig 4D：E15.5小鼠心臟的原位雜交也證實(shí)了前面的結(jié)論。
These data indicate that endothelial deletion of Ino80 impairs expression of Col15a1 in coronary vessels, which may play a role in ventricular non-compaction.

隨后作者通過小鼠心臟組織塊培養(yǎng)探究了重組Col15a1對心肌增殖的作用呻右。
Fig 4E：E12.5小鼠心臟組織塊被置于盤子上培養(yǎng)了1天跪妥，隨后給予重組蛋白或vehicle control 36h，然后進(jìn)行檢測声滥。

這樣做組織塊培養(yǎng)真的沒問題嗎眉撵？？？師姐說

Fig 4F, G：作者用磷酸化組蛋白H3 (phospho-H3) 和EDU檢測細(xì)胞增殖情況纽疟，發(fā)現(xiàn)給予外源重組Col15a1刺激的正常心肌細(xì)胞出現(xiàn)了增殖增加罐韩。
Fig 4H：在心肌增殖下降的Ino80 cKO小鼠，給予Col15a1刺激之后污朽，心肌細(xì)胞增殖出現(xiàn)增加散吵。
Fig 4I：給予Vegfr抑制劑s100a5抑制心肌增殖，給予Col15a1刺激之后蟆肆，心肌細(xì)胞增殖也恢復(fù)矾睦。
Fig 4J：在作者此前的研究中，LVNC患者iPSC誘導(dǎo)的心肌出現(xiàn)降低的增殖潛能颓芭。為了探究Col15a1是否能促進(jìn)人類心肌細(xì)胞增殖顷锰，作者對LVNC iPSC-CMs使用了Col15a1刺激柬赐，發(fā)現(xiàn)給予了Col15a1刺激的LVNC iPSC-CMs增殖能力與正常的iPSC-CMs接近亡问。

這些結(jié)果顯示，冠脈血管來源的Col15a1可以促進(jìn)心肌增殖肛宋，Col15a1在Ino80缺陷的乳鼠中下降州藕，可能參與了非致密性心肌病表型。

4. Defective endocardium expresses secreted factors that inhibit cardiomyocyte proliferation and stimulate maturation

在Fig1D中酝陈，作者在LVNC中鑒定出了一群mutant-specific內(nèi)皮細(xì)胞群床玻，因此作者推測這群細(xì)胞可能在心肌致密化過程中分泌一些分子影響周圍心肌。
Fig 5A：作者計算了Ino80缺陷鼠心臟中在這群mutant-specific EC的上調(diào)基因沉帮，找到了Tgfbi, Igfbp3, Isg15和Adm锈死。但是這些基因都不是mutant-specific EC特異性表達(dá)的。在這幾個基因中穆壕，作者最關(guān)注Tgfbi待牵，因?yàn)樵谒麄兇饲暗难芯恐校薒VNC iPSC-CMs出現(xiàn)了異常的TGF-b信號喇勋。
Fig 5B-D：驗(yàn)證這幾個基因的高表達(dá)缨该。
Thus, these genes constitute a list of secreted factors whose expression is positively correlated with ventricular non-compaction in mice.

隨后作者想要知道這些基因表達(dá)改變是Ino80敲除的直接后果還是受損的冠脈新生和心室非致密化（如缺氧）的組織水平反應(yīng)。

Fig 6A：作者對單細(xì)胞數(shù)據(jù)中的內(nèi)皮Endo和冠脈內(nèi)皮CV川背，Tie2Cre;Ino80^fl/fl心臟E13.5和E14.5（尚未出現(xiàn)嚴(yán)重致密化異常表型）的bulk RNAseq數(shù)據(jù)贰拿，轉(zhuǎn)染了Ino80-specific siRNA的人臍靜脈內(nèi)皮(HUVECs)的bulk RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合分析，發(fā)現(xiàn)Tgfbi和Isg15在Ino80敲除的HUVECs和Tie2Cre;Ino80^fl/fl心臟中出現(xiàn)上調(diào)熄云。這個現(xiàn)象提示Isg15和Tgfbi可以直接受Ino80調(diào)控膨更，而Igfbp3和Adm的上調(diào)可能是組織缺氧的結(jié)果（在別的文獻(xiàn)中也有報道，這些基因?qū)儆趆ypoxia-inducible genes）

隨后作者想要使用小鼠和人的心肌細(xì)胞去驗(yàn)證Ino80缺陷的心內(nèi)膜和冠脈內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)分泌因子抑制心肌致密化這個假說缴允。作者給予心肌細(xì)胞的刺激包括單獨(dú)給予上面鑒定出來的四種分子 (Tgfbi, gfbp3, Isg15, or Adm) 或四個一起給 (4 factors or ‘4F’)荚守。采取的方法還是前面Fig 4E的方法。
Fig 6B：Phospho-H3免疫染色提示Tgfbi和Isg15降低了心肌細(xì)胞增殖。
Fig 6C：EDU的結(jié)果提示單給這四種因子或一起給都可以降低心肌增殖健蕊。
Fig 6D：給iPSC-CMs四種因子或一起給也可以抑制細(xì)胞增殖菱阵。
Fig 6E-G：作者還發(fā)現(xiàn)了與非致密化相關(guān)的結(jié)構(gòu)變化。組織塊培養(yǎng)的心肌細(xì)胞在給予了四種因子/4F刺激之后缩功，致密化程度要高于control晴及。
Fig 6H：另外一個心肌非致密化的結(jié)構(gòu)變化是premature cardiomyocyte maturation. 在更早的發(fā)育階段，Ino80 mutant的心肌展示出更有組織的肌節(jié)結(jié)構(gòu)嫡锌。免疫熒光顯示4F和Tgfbi treated iPSC-CMs將心肌細(xì)胞從環(huán)形的形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱烁幸?guī)則的肌節(jié)虑稼，心肌成熟變得正常。Thus, secreted factors whose expression was increased in Ino80-deficient endocardial and ECs sup- press cardiomyocyte proliferation, a hallmark feature of ventricular non-compaction.
Fig 6I-K：心肌細(xì)胞成熟的另一個特征是電生理特性的改變势木。膜片鉗結(jié)果顯示和control相比蛛倦，4F干預(yù)增加了最大上升速率和動作電位幅度。此外啦桌，給予干預(yù)的細(xì)胞的靜息電位從-60變到了-70mV溯壶，提示IK1 channel的電流增加。這些結(jié)果提示電生理成熟的增強(qiáng)甫男。
Taken together, these data show that, in culture, endocardial-derived factors overexpressed in Ino80-mutant ECs can drive the structural phenotypes seen in non-compacted hearts.

5. General inhibition of coronary angiogenesis recapitulates non-compaction

前面的結(jié)果顯示冠脈血管表達(dá)分泌因子刺激心肌增殖且改，提示冠脈血管生成可以引起非致密化，而這個過程并不依賴于Ino80板驳。
Fig 7A：為了驗(yàn)證這個假說又跛，作者使用不同的抑制冠脈血管生成的基因鼠，分析了心室壁的發(fā)育若治。AplnCreER被用于在E12.5和E13.5時間點(diǎn)清除VEGFR2慨蓝，并在E16.5時對小鼠進(jìn)行了采樣和檢測。

AplnCreER is specific to coronary ECs in the developing heart and VEGFR2 is required for general EC growth, allowing us to specifically inhibit coronary angiogenesis without affecting the endocardium.

Fig 7B, C：在E16.5檢測小鼠心肌小梁和致密心肌寬度顯示出compact expansion的缺陷和over-developed trabeculae端幼。

因此礼烈，作者認(rèn)為general coronary vessel inhibition can lead to non-compaction in mice.

6. Adult phenotype of embryos exhibiting non-compaction

隨后作者想要去探究是否在Tie2Cre;Ino80^fl/fl小鼠胚胎心臟上觀測到的明顯表型在adult中也存在。因此作者將小鼠養(yǎng)殖到成年静暂，觀測了心臟室壁形態(tài)和心臟功能济丘。
Fig 8A：作者首先觀測到了Tie2Cre;Ino80^fl/fl的致死現(xiàn)象，因此沒有足夠多的小鼠活到成年洽蛀。這種致死現(xiàn)象可能是由于嚴(yán)重的心室非致密化摹迷。但由于這是一個pan-endothelial Cre，所以不能排除其他血管床和血細(xì)胞的影響郊供。因此作者選擇了更加特異性的Cre：Nfatc1Cre（specific to endocardial cells in the heart）峡碉。Nfatc1Cre;Ino80^fl/fl小鼠死亡率相對較低。隨后作者對存活小鼠心臟進(jìn)行了檢測驮审。
Fig 8B：HE結(jié)果顯示Nfatc1Cre;Ino80^fl/fl小鼠心臟并沒有廣泛的小梁形成鲫寄，但是幾乎所有的心臟都要比Nfatc1Cre;Ino80^fl/+小鼠心臟大吉执。
Fig 8C, D：超聲心動圖的結(jié)果顯示心臟收縮功能明顯受損，左室射血分?jǐn)?shù)降低地来，舒張末期容積下降戳玫，左室mass增加。和B圖的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)相一致未斑。
這些結(jié)果顯示敲除心內(nèi)膜和(部分)冠脈EC的Ino80咕宿，會引起輕微的胚胎心室致密不全，進(jìn)一步引起成年心臟的功能異常蜡秽。

總結(jié)：

參考文獻(xiàn)：

1. Rhee S, Chung JI, King DA, D’amato G, Paik DT, Duan A, Chang A, Nagelberg D, Sharma B, Jeong Y, Diehn M, Wu JC, Morrison AJ, Red-Horse K. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nat Commun 2018;9:368.