Sci Adv | 袁健組發(fā)現(xiàn)DNA損傷激活自噬新機(jī)制

Sci Adv | 袁健組發(fā)現(xiàn)DNA損傷激活自噬新機(jī)制

原創(chuàng) BioArt

自噬是一種進(jìn)化高度保守的生理過程乔煞,在清理錯(cuò)誤折疊洋腮、過量累積的蛋白以及破損的細(xì)胞器、維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等過程具有重要的作用。在多種細(xì)胞脅迫的條件下(例如,饑餓铡原、低氧偷厦、病原微生物的入侵、活性氧等)能夠激活自噬燕刻;隨著研究的進(jìn)展只泼,人們發(fā)現(xiàn)DNA損傷是激活自噬的一大主要因素之一。DNA損傷激活的自噬參與了DNA損傷修復(fù)卵洗、細(xì)胞程序性死亡请唱、細(xì)胞衰老以及細(xì)胞因子的分泌等過程的調(diào)控,其對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性發(fā)揮著重要的作用忌怎。此外籍滴,大量研究表明化療過程中激活高活性的自噬通常會(huì)導(dǎo)致化療耐受酪夷,聯(lián)合自噬抑制劑和化療藥物已成為一種很有希望克服化療耐受的治療方法榴啸。
關(guān)鍵自噬相關(guān)蛋白(ATGs)的翻譯后修飾(例如,磷酸化晚岭、乙跖赣。化、泛素化等)在DNA損傷激活的自噬的調(diào)控作用已經(jīng)得到了很好的證實(shí)和研究坦报。然而库说,是否在轉(zhuǎn)錄水平上也參與了DNA損傷激活的自噬的調(diào)控,目前還不是很清楚片择。
2020年1月1日潜的,同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院袁健
課題組在**Science Advances 發(fā)表題為 “The CHK2—FOXK axispromotes transcriptional control of autophagy” 的論文,闡明了DNA損傷轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控自噬的新機(jī)制字管,此外啰挪,也為聯(lián)合化療藥物和自噬抑制克服化療耐受提供新的證據(jù)和潛在生物標(biāo)志物。

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CHK2 是一種關(guān)鍵的DNA損傷應(yīng)答蛋白(DDR)嘲叔,具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸激酶活性亡呵,其通過磷酸化多個(gè)下游底物例如p53、BRCA1硫戈、PML等參與細(xì)胞周期锰什,凋亡、DNA損傷等生理過程的調(diào)控丁逝。多個(gè)DDR蛋白(例如ATR汁胆、ATM、CHK2等)已被證實(shí)能夠參與DNA損傷激活自噬的調(diào)控霜幼,但關(guān)于CHK2能否調(diào)控自噬嫩码,目前還不清楚。

在該研究中辛掠,作者們首先使用Cisplatin等化療藥物處理A549或者HEPG2細(xì)胞谢谦,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加細(xì)胞自噬水平逐漸增強(qiáng)释牺。此外,關(guān)鍵自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)(MapLC3B回挽、p62没咙、ATG5、ATG7千劈、ULK1祭刚、Beclin1等)也隨著處理藥物濃度的增加表達(dá)漸增多。進(jìn)一步地墙牌,通過qPCR分析涡驮,發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵自噬相關(guān)基因的的轉(zhuǎn)錄水平也隨著處理藥物濃度的增加也進(jìn)一步增強(qiáng),這表明喜滨,在轉(zhuǎn)錄水平上參與了Cisplatin捉捅、Etoposide誘導(dǎo)的自噬激活。為了進(jìn)一步闡明這個(gè)過程的發(fā)生機(jī)制虽风,作者們通過聯(lián)合化療藥物和關(guān)鍵DDR蛋白的抑制劑(ATMi棒口、ATRi、CHK2i辜膝、CHK1i)處理細(xì)胞无牵,然后檢測(cè)自噬的自噬水平和關(guān)鍵自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)現(xiàn)厂抖,ATM或者CHK2抑制劑能夠顯著抑制Cisplatin誘導(dǎo)的自噬激活以及鍵自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄茎毁。此外,通過shRNA介導(dǎo)穩(wěn)定敲低CHK2的表達(dá)也顯著的抑制Cisplatin激活的自噬忱辅,這表明CHK2在DNA損傷激活的自噬中具有重要的調(diào)控作用七蜘。

為了闡明CHK2調(diào)控自噬的分子機(jī)制,通過質(zhì)譜分析耕蝉,作者們發(fā)現(xiàn)FOXK2蛋白是一個(gè)新的潛在CHK2結(jié)合蛋白崔梗。FOXK(FOXK1和FOXK2蛋白的合稱)蛋白是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白,其可作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子通過結(jié)合到大量關(guān)鍵自噬基因(MapLC3B垒在、p62蒜魄、ATG5、ATG7场躯、ULK1谈为、Beclin1等)的啟動(dòng)子上并抑制這些基因的表達(dá),從而抑制自噬的發(fā)生踢关。進(jìn)一步的通過Co-IP實(shí)驗(yàn)伞鲫,作者們發(fā)現(xiàn)在由化療藥物Cisplatin等誘導(dǎo)DNA損傷的條件下,激活A(yù)TM-CHK2信號(hào)通路签舞,進(jìn)而促進(jìn)CHK2與FOXK蛋白發(fā)生相互作用秕脓。CHK2與FOXK蛋白的相互作用是CHK2 T68的磷酸化依賴性的柒瓣,此外FOXK蛋白的FHA結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與CHK2發(fā)生相互作用。

CHK2是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶吠架,其傾向于磷酸化具有RXXS/T保守序列的底物芙贫。通過對(duì)比分析FOXK1以及FOXK2在不同物種間的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)FOXK1的第130位絲氨酸以及FOXK2的第61位絲氨酸是潛在的CHK2磷酸化位點(diǎn)傍药。接著磺平,通過一系列的體內(nèi)、外磷酸化實(shí)驗(yàn)以及訂制特性同時(shí)能夠識(shí)別FOXK1的第130位絲氨酸以及FOXK2第61位絲氨酸的磷酸化位點(diǎn)的抗體拐辽,發(fā)現(xiàn)在DNA損傷的條件下拣挪,CHK2被激活進(jìn)而磷酸化FOXK蛋白(FOXK1在第130位絲氨酸和FOXK2在第61位絲氨酸)。此外俱诸,在Cisplatin處理的條件下FOXK蛋白能夠發(fā)生從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移菠劝。進(jìn)一步地通過敲低CHK2或者突變CHK2介導(dǎo)FOXK蛋白磷酸化的位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)FOXK蛋白從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移顯著受到了抑制乙埃。這表明DNA損傷誘導(dǎo)FOXK蛋白從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)是由CHK2介導(dǎo)的闸英。那在DNA損傷的條件下,CHK2介導(dǎo)FOXK的磷酸化從而誘導(dǎo)FOXK從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)具有什么功能呢介袜?在聯(lián)合敲低FOXK1和FOXK2的細(xì)胞中分別回補(bǔ)野生型的FOXK(FOXK WT)以及模擬FOXK去磷酸化的突變FOXK SA(FOXK1 1S130A 和FOXK2 S61A),通過Western Blot出吹,IF以及qPCR等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的自噬水平遇伞,發(fā)現(xiàn)在DNA損傷的條件下, 與攜帶FOXK SA突變型的細(xì)胞相比攜帶FOXK WT的細(xì)胞激活了關(guān)鍵自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而激活自噬。進(jìn)一步的通過克隆形成實(shí)驗(yàn)捶牢,檢測(cè)了攜帶FOXK 野生型以及FOXK SA突變型的細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性鸠珠,發(fā)現(xiàn)與攜帶FOXK 野生型的細(xì)胞相比攜帶FOXK SA突變型的細(xì)胞對(duì)Cisplatin更加敏感,當(dāng)聯(lián)合使用自噬抑制劑(CQ秋麸,chloroquine)以及Cisplatin處理細(xì)胞時(shí)可顯著提高Cisplatin對(duì)細(xì)胞的殺傷作用渐排,此外還可以消除攜帶FOXK 野生型的細(xì)胞以及攜帶FOXK SA細(xì)胞對(duì)Cisplatin敏感性之間的差異。這表明化療藥物誘導(dǎo)高活性的自噬會(huì)導(dǎo)致化療耐受灸蟆。

進(jìn)一步的通過分析TGCA數(shù)據(jù)庫驯耻,發(fā)現(xiàn)在毗鄰CHK2介導(dǎo)FOXK蛋白磷酸化位點(diǎn)附近存在一些突變(FOXK1 I125M、FOXK1 N28K以及FOXK2 I56F炒考、FOXK2 N59K)可缚,通過構(gòu)建相關(guān)位點(diǎn)突變的質(zhì)粒,然后檢測(cè)這些突變對(duì)CHK2介導(dǎo)FOXK磷酸化斋枢、FOXK蛋白的定位帘靡、DNA損傷激活的自噬以及化療藥物敏感性的的影響,發(fā)現(xiàn)與野生型的細(xì)胞相比瓤帚,在DNA損傷的條件下描姚,F(xiàn)OXK1 N128K的突變以及FOXK2 N59K的突變誘導(dǎo)CHK2介導(dǎo)FOXK蛋白的高磷酸化涩赢,進(jìn)一步促進(jìn)FOXK蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位以及細(xì)胞自噬。通過體外克隆形成實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)的裸鼠形成實(shí)驗(yàn)轩勘,發(fā)現(xiàn)與野生的細(xì)胞相比攜帶FOXK NK(FOXK1 N128K和FOXK2N59K)突變的細(xì)胞對(duì)cisplatin更為耐受谒主,當(dāng)使用自噬抑制劑和化療藥物聯(lián)合使用時(shí)可以消除FOXK NK突變導(dǎo)致的耐受。這表明FOXK NK突變通過誘導(dǎo)高活性的自噬進(jìn)而導(dǎo)致化療耐受赃阀。

綜上所述霎肯,該研究闡明了通過CHK2-FOXK信號(hào)軸調(diào)控DNA損傷誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制;鑒定出FOXK蛋白是新的CHK2的底物并找出FOXK1的130位絲氨酸(FOXK1 S130)榛斯、FOXK2的第61位絲氨酸(FOXK2 S61)是CHK2在DNA損傷條件下介導(dǎo)的FOXK磷酸化位點(diǎn)观游,進(jìn)一步的通過體內(nèi)外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CHK2通過FOXK蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA損傷誘導(dǎo)的自噬并進(jìn)一步驗(yàn)證了化療藥物誘導(dǎo)高活性的自噬會(huì)導(dǎo)致化療耐受,聯(lián)合自噬抑制劑可以顯著提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果驮俗。此外懂缕,本研究發(fā)現(xiàn)鄰近CHK2介導(dǎo)FOXK磷酸化位點(diǎn)的突變(FOXK1N128K、FOXK2 N59K)會(huì)誘導(dǎo)高活性的自噬王凑,進(jìn)而導(dǎo)致化療耐受搪柑,但在聯(lián)用自噬抑制劑和化療藥物可以消除這個(gè)突變導(dǎo)致的化療耐受。這些結(jié)果表明索烹,CHK2介導(dǎo)的FOXK蛋白的磷酸化水平是潛在聯(lián)合化療藥物和自噬抑使用克服化療耐受的生物標(biāo)志物工碾。

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袁健教授課題組的博士研究生陳玉平以及碩士研究生錦歡是本文的第一作者,袁健教授為本文的唯一通信作者百姓。原文鏈接:https://advances.sciencemag.org/content/6/1/eaax5819

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