一、研究背景
1. 子宮內(nèi)膜癌的分類和流行病學(xué)
（1）子宮內(nèi)膜癌（Endometrial Cancer, EC）主要分為以下兩種類型：
①子宮內(nèi)膜樣腺癌（Endometrioid Endometrial Cancer, EEC）：這是最常見的類型苫纤，通常與雌激素依賴性有關(guān)埋虹，預(yù)后相對較好堪遂。
②漿液性子宮內(nèi)膜癌（Serous Endometrial Cancer, SEC）：這是另一種重要的類型秩冈，通常不依賴于雌激素，生物學(xué)行為更具侵襲性沃测，預(yù)后較差缭黔。
??此外，根據(jù)發(fā)病機制和生物學(xué)行為特點將子宮內(nèi)膜癌分為雌激素依賴型（Ⅰ型）和非雌激素依賴型（Ⅱ型）蒂破。雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌大部分病理類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌馏谨，少部分為黏液腺癌；非雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌病理類型包括漿液性癌寞蚌、透明細(xì)胞癌田巴、癌肉瘤等。
（2）流行病學(xué)
??近年來挟秤，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈上升趨勢壹哺，這可能與人群生活方式的改變以及激素暴露等因素有關(guān)，隨著社會老齡化和城鎮(zhèn)化的加劇艘刚，子宮內(nèi)膜癌已逐漸成為影響女性健康的主要生殖道惡性腫瘤之一管宵。2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，子宮內(nèi)膜癌新發(fā)病例達(dá)417,367例攀甚，新增死亡病例達(dá)97,370例箩朴，EEC占所有EC病例的65-85%。因此秋度，對EEC腫瘤發(fā)生機制的全面理解將有助于改進(jìn)該疾病的診斷和治療炸庞。
2. EEC的發(fā)病機制和細(xì)胞起源
EEC的發(fā)病機制：在長期暴露于沒有孕激素保護(hù)的雌激素下，子宮內(nèi)膜會出現(xiàn)不受控制的增生荚斯，從正常子宮內(nèi)膜發(fā)展到不典型子宮內(nèi)膜增生（AEH埠居，EEC的癌前階段），最終發(fā)展為EEC事期。
EEC的細(xì)胞起源：以前的研究推測EEC可能起源于子宮內(nèi)膜的各種細(xì)胞譜系滥壕，包括上皮細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞。然而兽泣，最近的一項研究報道绎橘，鼠子宮內(nèi)膜中的Axin2陽性上皮干細(xì)胞在激活Ctnnb1基因后可以發(fā)展為EEC。
科學(xué)問題：迄今為止唠倦，現(xiàn)有證據(jù)不足以明確支持EEC的具體起源称鳞。
3. 單細(xì)胞測序（scRNA-seq）技術(shù)
相比于傳統(tǒng)RNA測序（bulk RNA-seq）涮较，scRNA-seq可以根據(jù)單細(xì)胞分辨率下的特征轉(zhuǎn)錄組將組織中成千上萬的細(xì)胞歸類為特定的細(xì)胞簇。通過分析從正常子宮內(nèi)膜到子宮內(nèi)膜樣腺癌（EEC）病理進(jìn)展中的細(xì)胞群體演變和轉(zhuǎn)錄變化胡岔，可以幫助理解EEC的病理進(jìn)程法希。
4. 腫瘤微環(huán)境（Tumor Microenvironment, TME）在EEC中的作用
腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）和抑制性免疫微環(huán)境促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌增殖和轉(zhuǎn)移。根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤靶瘸，Li, B. L.等將TME分為C1-C4型，其中C1免疫亞型巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤最少毛肋，最高的轉(zhuǎn)移率和最差的總體預(yù)后怨咪。C2免疫亞型IFN-γ通路活躍，巨噬細(xì)胞極化為M1型润匙，較差的生存率诗眨。C3免疫亞型為炎癥類型，免疫活動最強孕讳，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤最多匠楚，顯著的Th17特征，具有最高的總體生存率厂财。C4免疫亞型為免疫平衡類型芋簿，免疫細(xì)胞浸潤和平衡的免疫通路激活，預(yù)后中等璃饱。但從正常子宮內(nèi)膜到EEC形成過程中TME的全貌仍然不清楚与斤。揭示從正常子宮內(nèi)膜到EEC過程中TME的特征變化，可以確定TME在EEC腫瘤發(fā)生中的功能荚恶。
Li, B. L. & Wan, X. P. Prognostic significance of immune landscape in tumour microenvironment of endometrial cancer. J. Cell Mol. Med 24, 7767–7777 (2020). https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jcmm.15408
Subramaniam, K. S. et al. Cancer-associated fibroblasts promote proliferation of endometrial cancer cells. PLoS One 8, e68923 (2013). https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0068923
二撩穿、擬解決的科學(xué)問題
- EEC的細(xì)胞起源和轉(zhuǎn)錄組變化如何影響疾病的發(fā)展和進(jìn)展？
- EEC是如何從正常內(nèi)膜經(jīng)歷非典型子宮內(nèi)膜增生（AEH）向內(nèi)膜樣癌發(fā)展演變的谒撼？
- EEC的細(xì)胞群體組成和拷貝數(shù)變異在病理進(jìn)程中的動態(tài)變化如何影響腫瘤微環(huán)境食寡？
三、研究內(nèi)容
1. 利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)廓潜，對正常抵皱、AEH和EEC子宮內(nèi)膜組織中的細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定和分類。
a. 經(jīng)過質(zhì)控茉帅，總共有99,215個細(xì)胞被收集叨叙，每個細(xì)胞平均檢測到2317個基因。
根據(jù)之前報道的細(xì)胞標(biāo)志物堪澎，作者識別出六種主要的已知細(xì)胞類型：上皮細(xì)胞（EPCAM擂错、CDH1）、間質(zhì)成纖維細(xì)胞（DCN樱蛤、COL6A3）钮呀、內(nèi)皮細(xì)胞（PECAM1剑鞍、PCDH17）、淋巴細(xì)胞（CCL5爽醋、STK17B）蚁署、巨噬細(xì)胞（MS4A6A、CD68）和成纖維細(xì)胞（ACTA2蚂四、RGS5）光戈。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了一種新的上皮細(xì)胞類型遂赠，稱為“無纖毛上皮細(xì)胞”久妆，這種細(xì)胞類型在之前的實驗中被描述為“無纖毛上皮細(xì)胞”（EPCAM + CDHR3-FOXJ1-）。
b. t-SNE降維圖展示不同細(xì)胞類群
c. 展示了每個定義的細(xì)胞類型的表達(dá)熱圖跷睦，以反映細(xì)胞群體的特異性筷弦。
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2. 研究正常、AEH和EEC子宮內(nèi)膜組織中不同細(xì)胞類型的比例和分布情況抑诸。
Increased epithelium is the pathological manifestation of endometrial
carcinoma [22.] However, dynamic changes in the proportion of all cell
types from normal endometrium, to AEH, and to EEC have not been
reported.
(1) 單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析提示：上皮細(xì)胞的比例在AEH中增加烂琴，并在EEC中進(jìn)一步擴大。同時蜕乡，間質(zhì)成纖維細(xì)胞的比例從正常子宮內(nèi)膜到EEC發(fā)生了顯著下降奸绷。該結(jié)論通過組織免疫熒光進(jìn)行驗證。此外异希，每組細(xì)胞類群的特征基因均值與正常組進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析健盒，再次說明AEH和EEC的上皮細(xì)胞類群與正常組顯著不同。
image.pngimage.pngSpearman correlation.png
(2) 拷貝數(shù)變異(CNVs)分析提示：AEH和EEC中的上皮細(xì)胞的CNVs與正常組相比存在顯著增加（5個EEC樣本中CNVs的分布與正常組相比称簿，也提示上皮細(xì)胞CNVs增加扣癣，而組內(nèi)沒有顯著差異）。接下來憨降，通過將正常上皮作為對照父虑，分析AEH和EEC樣本中上皮細(xì)胞的單細(xì)胞CNVs，并基于轉(zhuǎn)錄組推斷大范圍的染色體CNVs授药，發(fā)現(xiàn)高CNVs通常發(fā)生在染色體1士嚎、8或10上（補充圖3c）。這與TCGA數(shù)據(jù)集的結(jié)果一致悔叽，表明這些可能是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展的典型CNV亞克隆莱衩。
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以上結(jié)果提示具有高CNVs的上皮細(xì)胞可能子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，然而其具體細(xì)胞起源仍不清楚娇澎。
3. 明確EEC中上皮樣腫瘤細(xì)胞的起源
①根據(jù)文獻(xiàn)笨蚁，EEC腫瘤細(xì)胞來源可能是間充質(zhì)干細(xì)胞或子宮內(nèi)膜上皮干細(xì)胞。
②根據(jù)上皮細(xì)胞比例增加伴隨著間質(zhì)成纖維細(xì)胞比例的減少，提示間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（MET）可能是EEC腫瘤細(xì)胞的來源
（1）RNA velocity analysis（上皮和間質(zhì)細(xì)胞分別為兩個獨立的進(jìn)化軌跡括细，未見相互轉(zhuǎn)化的軌跡）和MET基因表達(dá)分布伪很。此外，根據(jù)上皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞的特異性marker分布奋单，未發(fā)現(xiàn)MET或MET等轉(zhuǎn)化細(xì)胞類型（即兩種marker共表達(dá)的細(xì)胞類群）锉试。提示EEC腫瘤細(xì)胞主要起源于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。
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(2) 分組（split）t-SNE顯示14,28細(xì)胞群在AEH和EEC中顯著增多览濒，根據(jù)marker基因在t-SNE圖顯示結(jié)果發(fā)現(xiàn)呆盖，14,28細(xì)胞群屬于unciliated上皮細(xì)胞（EPCAM+WFDC2+CDHR3-FOXJ1-）。提示EEC腫瘤細(xì)胞可能起源于unciliated上皮細(xì)胞匾七。
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(3) 提取unciliated上皮細(xì)胞進(jìn)行subpopulation細(xì)分絮短，發(fā)現(xiàn)健康組的unciliated上皮細(xì)胞主要有 glandular cells (FOXA2, SMAD9) or luminal cells (WNT7A)組成，而EEC的unciliated上皮細(xì)胞在不同樣本間的異質(zhì)性較大昨忆，其中clusters 14, 15, 26, and 32在EEC中分布較一致，信號通路分析發(fā)現(xiàn) clusters 14 and 15 主要富集TNF and IL-17 信號通路, clusters 26 and 32 主要富集Hippo and Wnt 等與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路杉允。進(jìn)一步使用RNA velocity analysis發(fā)現(xiàn)這群腫瘤細(xì)胞亞群主要來源于unciliated中的Glandular上皮細(xì)胞邑贴。通過Findmaker得到這群腫瘤細(xì)胞的基因特征，并命名為 LCN2+/SAA1/2+ unciliated epithelial cells叔磷。
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(4) 組織免疫熒光驗證
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(5) TCGA數(shù)據(jù)驗證
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以上結(jié)果說明EEC腫瘤細(xì)胞主要起源于子宮內(nèi)膜unciliated上皮細(xì)胞拢驾，并特征性高表達(dá) LCN2和SAA1/2，且與EEC預(yù)后相關(guān)改基。
4. 探討腫瘤相關(guān)基質(zhì)成纖維細(xì)胞（cancer-associated stromal fibroblasts繁疤，CAFs）對EEC發(fā)生發(fā)展的作用
(1) 提取stromal fibroblast進(jìn)行subpopulation細(xì)分，通過FindeMarkers識別不同亞群的特征性基因秕狰，使用常見標(biāo)志物和KEGG信號通路富集分析對亞群進(jìn)行標(biāo)記稠腊，并對細(xì)胞亞群的百分比進(jìn)行組間比較，發(fā)現(xiàn)BMP + fibroblast (positive
for BMP3, BMP4 and BMP7)在EEC中比例稍微升高鸣哀， 而WNT subtype, pericyte, and myofibroblast無明顯差異架忌，提示stromal fibroblast在健康內(nèi)膜和EEC發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用？
(2) 提取健康內(nèi)膜和EEC腫瘤組織中的stromal fibroblast和EEC類器官進(jìn)行共培養(yǎng)我衬，檢測stemness-related genes (ALDH1, AXIN2, CD133, MYC, and SOX9)的RNA水平叹放，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康內(nèi)膜或EEC腫瘤組織的stromal fibroblast均可上調(diào)EEC類器官細(xì)胞的干性指標(biāo)。說明所有類型的stromal fibroblast在健康內(nèi)膜和EEC發(fā)生發(fā)展中同樣重要挠羔？
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方法學(xué)：根據(jù)基質(zhì)細(xì)胞更易解離的特性井仰，分離基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞
5. 探討免疫微環(huán)境在EEC中的特征及作用
(1) 提取免疫細(xì)胞（
提取一開始進(jìn)行分群的Lymphocyte和Macrophage？）進(jìn)行亞群細(xì)分破加，通過FindeMarkers識別不同亞群的特征性基因俱恶，使用常見標(biāo)志物CD3D + T cells, CD68 + macrophages, NCAM1 + NK cells, CD1A + dendritic cells, CD79A + B cells, KIT + mast cells, and FCGR3B + neutrophils進(jìn)行亞群標(biāo)記，組間比較亞群比例，結(jié)果提示T細(xì)胞速那、B細(xì)胞俐银、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞端仰、中性粒細(xì)胞捶惜、肥大細(xì)胞在健康內(nèi)膜、AEH和EEC中的分布沒有顯著差異荔烧。但是吱七，Lymphocyte和Macrophage在總的細(xì)胞分布下，其細(xì)胞比例在AEH和EEC中較健康內(nèi)膜是上調(diào)的鹤竭，這里的免疫細(xì)胞大類分群踊餐，是否應(yīng)該在所有細(xì)胞下進(jìn)行？
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(2) 對單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行分群：傳統(tǒng)M1 (positive for IL1A and IL1B) and M2 (positive for CD163 and IL10)不能對Macrophage進(jìn)行分群臀稚。根據(jù)其他疾病的單細(xì)胞數(shù)據(jù)研究成果https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286742030341X和https://www.nature.com/articles/s41591-020-0901-9吝岭，使用FCN1 + (cluster1), SPP1 + (clusters 0, 3, 4) and cycling (cluster 2, positive for TYMS and MKI67) 對macrophages進(jìn)行標(biāo)記，并對相應(yīng)cluster的marker基因使用KEGG信號通路富集分析吧寺，明確該分類的可行性（FCN1+巨噬細(xì)胞與細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)窜管，SPP1+巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞活化有關(guān)，cycling巨噬細(xì)胞是一群具有增殖活性的巨噬細(xì)胞）稚机，與文獻(xiàn)報道的巨噬細(xì)胞亞群功能類似幕帆。但這3個巨噬細(xì)胞亞群在健康內(nèi)膜、AEH和EEC病灶之間的分布無顯著差異赖条。
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610813000330
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(3) 對T細(xì)胞進(jìn)行分群：根據(jù)文獻(xiàn)將CD8+ T細(xì)胞分為na?ve（靜息狀態(tài)或未激活的T細(xì)胞）失乾， cytotoxic（效應(yīng)T細(xì)胞）和exhausted（長期暴露于持續(xù)性抗原刺激和炎癥信號后逐漸失去其正常的免疫功能和效應(yīng)的T細(xì)胞），將CD4+ T細(xì)胞分為na?ve, exhausted和 regulatory（抑制和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的T細(xì)胞）纬乍。. In order to further define the state of CD8 T cell and CD4 T cell, we classified CD8 T cells as na?ve (positive for TCF7, IL7R, and CCR7), cytotoxic (positive for GNLY, GZMA, GZMB, and GZMH) and exhausted (positive for CTLA4, PDCD1, and HAVCR2), and CD4 T cells as na?ve (positive for TCF7, IL7R, and CCR7), exhausted (positive for CTLA4, PDCD1, and HAVCR2) and regulatory (Treg cell, positive for FOXP3 and TNFRSF4), based on the expression of reported marker genes.組間細(xì)胞比例結(jié)果發(fā)現(xiàn)碱茁，EEC腫瘤組織中CD8+ na?ve T細(xì)胞和cytotoxic T細(xì)胞比例均較健康內(nèi)膜顯著降低，CD4+ Treg細(xì)胞比例明顯增多蕾额，提示EEC處于抑制性T細(xì)胞的免疫微環(huán)境中早芭。
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四、總結(jié)
- 單細(xì)胞水平上揭示子宮內(nèi)膜癌特異地起源于內(nèi)膜無纖毛腺上皮細(xì)胞诅蝶，而非基質(zhì)細(xì)胞退个。
- 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、TCGA调炬、組織免疫熒光層面上明確LCN2+SAA1/2+上皮細(xì)胞是主要的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞起源语盈，聯(lián)合檢測對子宮內(nèi)膜癌總體生存有提示作用。
- 單細(xì)胞層面指出子宮內(nèi)膜癌處于T細(xì)胞抑制性免疫的腫瘤微環(huán)境中缰泡。
