又到了單細胞空間聯(lián)合分析的時間了选泻，今天我們參考的文獻在Recurrence of cancer cell states across diverse tumors and their interactions with the microenvironment，單細胞空間對于腫瘤極其微環(huán)境的研究還是主流啊~~~
ABSTRACT
雖然遺傳腫瘤異質(zhì)性早已被認識到，但最近的工作揭示了癌細胞在表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄水平上的顯著差異赏殃。在單個癌癥類型的單細胞水平上對腫瘤進行分析表明华嘹，轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性被表征成癌細胞狀態(tài)，這意味著不同的細胞狀態(tài)可能代表穩(wěn)定和功能單元橄唬，在腫瘤維持和進展中具有互補作用赋焕。然而，目前尚不清楚這些狀態(tài)在多大程度上跨越了腫瘤類型仰楚，構成了癌癥的一般特征隆判。此外，癌細胞狀態(tài)在腫瘤進展中的作用及其與腫瘤微環(huán)境細胞的特定相互作用仍有待闡明僧界。在這里侨嘀，對 15 種癌癥類型進行了泛癌單細胞 RNA-Seq 分析，并確定了 16 個基因模塊的目錄捎泻，這些模塊的表達定義了復發(fā)性癌細胞狀態(tài)飒炎，包括"stress”、‘interferon response’, ‘epithelial-mesenchymal transition’, ‘metal response’, ‘basal’ and ‘ciliated’笆豁。使用小鼠模型郎汪，發(fā)現(xiàn)干擾素反應模塊的誘導因腫瘤位置而異，并在淋巴細胞消除后減弱闯狱。此外煞赢，空間轉(zhuǎn)錄組學分析進一步將癌細胞中的干擾素反應與腫瘤微環(huán)境中的 T 細胞和巨噬細胞聯(lián)系起來。
Introduction
Transcriptional heterogeneity in cancer is increasingly recognized as a driver of tumor progression,metastasis and treatment failure(癌癥中的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性越來越被認為是腫瘤進展哄孤、轉(zhuǎn)移和治療失敗的驅(qū)動因素). Single-cell RNA-Sequencing (scRNA-Seq) has enabled the unbiased transcriptomic profiling of individual tumor cells and has revealed a striking amount of heterogeneity among malignant cells of the same tumor(單細胞確實是表征腫瘤最好的研究手段). Furthermore, evidence has emerged suggesting that transcriptional heterogeneity is organized into modules of co-expressed genes（腫瘤基因模塊）. Data from glioblastoma, oligodendroglioma, astrocytoma, head and neck cancer and melanoma among others, indicates that, within a tumor, cancer cells are heterogeneous in their degree of differentiation,ranging from stem- or progenitor-like to fully differentiated（在腫瘤內(nèi)照筑，癌細胞的分化程度是異質(zhì)的，從干細胞樣或祖細胞樣到完全分化）. These studies performed in a variety of cancer types have also shown the existence of cancer cell states related to stress response, interferon response, and hypoxia. While certain states have been found in multiple studies, a general catalog of cell states across cancer types remains to be established. Such a coherent framework - if it exists - would allow us to search for common themes across cancer types and to understand how tumors are organized independently of their origin.
Beyond malignant cells, tumors are composed of a complex microenvironment including immune and stromal cells, which also play critical roles in tumorigenesis（除了惡性細胞瘦陈，腫瘤由復雜的微環(huán)境組成凝危，包括免疫細胞和基質(zhì)細胞，它們在腫瘤發(fā)生中也起著關鍵作用）. In particular, the clinical success of immunotherapy across multiple cancers hints at commonalities in the interactions between cancer cells and the tumor microenvironment (TME). Causative links have been drawn between specific elements of the TME and cancer cell states. In one study of head and neck cancer, a population of partial epithelial-mesenchymal transition (pEMT) cancer cells at the leading edge of tumors was shown to interact with cancer-associated fibroblasts and mediate invasion. In glioblastoma and triple-negative breast cancer, factors of the TME appear to induce malignant cells to adopt a stem-like state. These works point to a need for a systematic analysis of cancer cell states, with a particular focus on the relation to the non-malignant cell types of the TME（這些工作表明需要對癌細胞狀態(tài)進行系統(tǒng)分析晨逝，特別關注與 TME 的非惡性細胞類型的關系 ）.
Here, we characterize recurrent cancer cell states and their relationship with the TME by systematically assaying 15 cancer types to identify a catalog of recurrent cancer cell states using a gene-centric approach（腫瘤劃類）. Analyzing scRNA-Seq data from previously published data as well as newly collected tumors, we identified 16 coherent gene modules and quantified their expression in malignant cells of each sample（模塊表征腫瘤細胞）. This catalog includes modules present in all studied tumors, as well as others that are specific to particular sets of cancer types（該目錄包括存在于所有研究腫瘤中的模塊蛾默，以及特定于特定癌癥類型集的其他模塊）. To further study the cancer cells states, we used experimental models to perturb the tumor microenvironment and test for differential effects on the cancer cell states（擾亂腫瘤微環(huán)境并測試對癌細胞狀態(tài)的不同影響）.While some of the states are related to known aspects of cancer biology, we present evidence that these processes are heterogeneously deployed by cells of the same tumor, and that this heterogeneity recurs across a wide range of cancer types. A detailed analysis of the interferon response module further led us to study its dependencies in vivo in the context of TME perturbations and to establish its proximity to macrophages and T cells across cancer types. Overall, the catalog of cancer cell states is a coherent representation of the makeup of a tumor, and provides a framework for the analysis and testing of the features of tumorigenesis（為分析和測試腫瘤發(fā)生的特征提供框架）。
Result
Recurring gene modules across diverse cancer types
在手術后立即收集了 19 個未經(jīng)治療的新鮮原發(fā)患者腫瘤捉貌，涵蓋 9 種癌癥類型支鸡。分離每個腫瘤以獲得單細胞懸液冬念，并在沒有事先分選的情況下處理 scRNA-Seq，以確保對腫瘤細胞組成的公正評估牧挣。腫瘤收集包括 9 種癌癥類型：卵巢癌 (OVCA)急前、子宮內(nèi)膜癌 (UCEC)、乳腺癌 (BRCA)瀑构、前列腺癌 (PRAD)裆针、腎癌 (KIRC)、肝癌 (LIHC)检碗、結腸癌 (COAD) 和胰腺癌 (PDAC) 据块，以及一種非上皮癌類型有缆，胃腸道間質(zhì)瘤 (GIST)异雁。首先通過使用標記基因、singleR 注釋和推斷的拷貝數(shù)變異的組合分析轉(zhuǎn)錄組资铡，并控制雙細胞的可能性來識別數(shù)據(jù)集中的惡性細胞怕犁。在樣本中边篮，注釋了 9,036 個惡性細胞和 18,546 個非惡性細胞。為了擴展數(shù)據(jù)集奏甫，還在先前發(fā)表的腫瘤中進行了這種分析戈轿，包括額外的 PDAC 和 LIHC，以及額外的腫瘤類型：膽管癌 (CHCA)阵子、肺腺癌 (LUAD)思杯、頭頸部鱗狀細胞癌 (HNSC)、皮膚鱗狀細胞癌 (SKSC)挠进、多形性膠質(zhì)母細胞瘤 (GBM)7 和少突膠質(zhì)細胞瘤 (OGD)色乾，共產(chǎn)生來自 62 個未經(jīng)治療的原發(fā)腫瘤的 19,942 個惡性細胞，涵蓋 15 種癌癥類型领突。
定義細胞狀態(tài)的方法首先涉及對底層基因模塊進行劃類暖璧，隨后最近的工作已將基因模塊確定為細胞狀態(tài)的定義特征（這個狀態(tài)的定義類似于hallmark）。這是一種靈活的方法君旦，因為它允許細胞表達模塊的組合澎办，從而允許細胞狀態(tài)的復雜性。使用非負矩陣分解 (NMF金砍，又是NMF局蚀，運用的太多了) 分析了惡性細胞，以將基因模塊識別為一組共表達的基因恕稠。我們的方法檢測樣本中共表達的基因組琅绅，即在細胞亞群中一致表達的基因組。為了在腫瘤中尋找重復出現(xiàn)的基因模塊谱俭，比較了已識別模塊的基因組成奉件。通過在基因模塊而不是表達矩陣的水平上進行整合，樣本和研究之間的技術變化的影響是有限的昆著。盡管在各種癌癥類型中獨立鑒定了這些模塊——因此不假設復發(fā)——發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤中獲得的模塊顯著重疊县貌。重要的是，這種重復而不是唯一性的發(fā)現(xiàn)也不是批次效應的結果凑懂。
基因模塊的重復能夠構建 16 個共有模塊的目錄煤痕，每個模塊的中位數(shù)為 37 個基因。為了確定模塊是否顯著存在于每個腫瘤的癌細胞群中接谨，使用了基因集過度分散度量摆碉。一些模塊豐富了特定的器官系統(tǒng)（如大腦或婦科器官），而其他模塊則涵蓋了多個器官系統(tǒng)和組織學脓豪。還在代表來自輸卵管巷帝、乳房和肝臟的正常上皮的獨立數(shù)據(jù)集中測試了模塊的過度分散，以詢問模塊是否反映了在正常組織中發(fā)現(xiàn)的異質(zhì)性的重建扫夜。對于大多數(shù)模塊楞泼，發(fā)現(xiàn)正常上皮樣本中的過度分散較低，這表明它們在正常組織中的表達差異不大笤闯。然而堕阔，模塊目錄確實在一定程度上在正常組織中檢測到的事實表明，這些模塊不是特定于癌癥的颗味，而是從現(xiàn)有模塊中選擇出來的超陆，并且表達更加異質(zhì)。還研究了模塊的基因組成和癌癥類型特異性浦马，將與細胞過程相關的模塊與與細胞身份相關的模塊區(qū)分開來时呀。
正如預期的那樣，恢復了一個由細胞周期基因（例如 TOP2A捐韩、PCNA）組成的高重復性模塊退唠，捕獲采樣時循環(huán)的任何腫瘤中的癌細胞亞群。 另一個在腫瘤類型中反復出現(xiàn)的過程是應激反應（例如荤胁，JUN瞧预、FOS、HSPA1B）仅政，此前已對其進行了描述并證明其在黑色素瘤的耐藥性中起作用垢油。 還在下面提供了空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)為在沒有解離的情況下癌細胞中這種狀態(tài)的體內(nèi)存在提供了額外的支持圆丹。
已在轉(zhuǎn)移性卵巢癌中發(fā)現(xiàn)的干擾素反應模塊廣泛存在滩愁，表明惡性細胞中的干擾素反應在一系列實體瘤類型中是異質(zhì)的。除了干擾素刺激的基因辫封，如 STAT1 和 IFIT1硝枉，該模塊還包含抗原呈遞的成分廉丽，干擾素的一種充分表征的作用，包括 MHC I 基因妻味，如 HLA-A 和 MHC II 基因正压，包括 HLA-DRA。雖然 MHC II 表達通常與專職抗原呈遞細胞相關责球，但該途徑也已顯示在正常上皮細胞和癌細胞中表達焦履。干擾素反應通常起到募集和激活免疫細胞的防御反應的作用，并已在癌癥中得到廣泛研究雏逾。在這種情況下嘉裤，干擾素配體可能由癌細胞和樹突狀細胞 (DC)（對于 I 型干擾素、IFNα 和 IFNβ）或自然殺傷 (NK) 和 T 細胞（對于 IFNγ）分泌栖博⌒汲瑁或者，干擾素反應可以是癌細胞內(nèi)在的笛匙，即獨立于其他細胞類型的信號而激活侨把；事實上，最近一項比較體外癌細胞系基因模塊的研究也確定了一個干擾素反應模塊妹孙，支持了 TME 獨立反應的可能性秋柄。
在一系列癌癥類型中還發(fā)現(xiàn)了兩個與代謝過程相關的模塊：缺氧模塊（例如，VEGF蠢正、ADM）和氧化磷酸化模塊（例如骇笔，ATP5H、LAMTOR2）嚣崭。 實體瘤中對缺氧的代謝適應笨触，伴隨著糖酵解增加和血管生成的誘導，與癌癥進展雹舀、耐藥性芦劣、侵襲和轉(zhuǎn)移有關。 盡管如此说榆，最近的研究表明氧化磷酸化在幾種癌癥類型中起作用虚吟，這表明癌細胞可能依靠糖酵解和氧化磷酸化來產(chǎn)生能量。 金屬硫蛋白基因的另一個基因模塊——在此稱為金屬反應模塊——可能在幾種癌癥類型的增殖和耐藥性中起作用签财。
另一組模塊對應于細胞身份串慰，似乎與組織和細胞起源有關。所分析的大多數(shù)腫瘤是上皮起源的唱蒸，因此確定了與已知上皮細胞類型標記重疊的模塊：肺泡模塊（例如邦鲫，AGER、CAV1）神汹，它特別存在于 LUAD59-61 中庆捺，以及基底（例如古今，KRT5 和 KRT15）、鱗狀（例如滔以，KLK10沧卢、LY6D）和腺（例如，CLU醉者、MUC5B）細胞模塊。由纖毛相關基因（例如 FOXJ1披诗、PIFO）組成的模塊存在于婦科腫瘤以及 LUAD 和 GBM 中撬即。在卵巢和子宮內(nèi)膜腫瘤中，該模塊僅存在于子宮內(nèi)膜樣樣本（OVCA NYU2-3呈队、UCEC NYU2-3）中剥槐，而不存在于高級別漿液性樣本（OVCA NYU1、UCEC NYU1）中宪摧，表明纖毛形成是一個特征子宮內(nèi)膜樣組織學粒竖。該模塊在正常輸卵管和肺上皮組織中的存在表明其在癌癥中的差異表達反映了起源組織的異質(zhì)性。在腫瘤內(nèi)觀察到的分化模塊的異質(zhì)表達可以從臨床病理學的角度提供對腫瘤結構的更詳細的理解几于，其中評估每個腫瘤的等級和組織學亞型蕊苗。
跨越多種癌癥類型的兩個模塊與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 相關：完整間充質(zhì)模塊 (cEMT)（例如 COL1A1、FN1）和部分間充質(zhì)模塊 (pEMT)（例如 LAMC2沿彭、VIM）缺乏典型的間充質(zhì)標志物朽砰，如膠原基因。 pEMT 模塊最近在 HNSC10 和 SKSC31 中得到表征喉刘，但也在 GBM7 中發(fā)現(xiàn)瞧柔，這表明來自不同譜系的細胞在癌癥中趨同于這種特性。 在少數(shù)樣本中檢測到 cEMT 模塊的存在睦裳，但包括一系列癌癥類型：主要是 PDAC造锅、CHCA、LUAD 和 GBM廉邑。 最近的一項研究表明哥蔚，pEMT 和 cEMT 可以發(fā)生在一系列癌癥類型中，并且可能代表了兩種途徑鬓催，它們?nèi)诤狭碎g充質(zhì)分化所賦予的表型特性肺素，包括遷移和耐藥性。 使用 TCGA 數(shù)據(jù)宇驾，確實發(fā)現(xiàn) pEMT 基因模塊的表達與無進展生存期降低有關倍靡。
最后，確定了三個神經(jīng)癌癥特異性模塊：星形膠質(zhì)細胞 (AC) 樣（例如 APOE课舍、ALDOC）塌西、少突膠質(zhì)祖細胞 (OPC) 樣（例如 OLIG1他挎、OLIG2）和神經(jīng)祖細胞 (NPC) 樣（例如 DLX1 , DLX5) 模塊。
這些模塊在一系列癌癥類型中的廣泛發(fā)生突出了分化程序的重新部署以及癌癥和正常組織中不同的表達水平捡需。 此外办桨，雖然已鑒定的許多基因與癌癥生物學的各個方面有關，但單細胞方法使我們能夠證明它們在腫瘤的惡性細胞中異質(zhì)表達站辉，并且通常在惡性上皮細胞中表達水平高于正常上皮細胞呢撞。
為了測試是否也可以使用獨立的方法檢測 16 個模塊的類別，使用了 SCENIC饰剥，這是一種識別表達相關且受相同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的基因的方法殊霞。 發(fā)現(xiàn)我們目錄中的每個模塊都與幾個 SCENIC 調(diào)節(jié)子有顯著的重疊。 例如汰蓉，干擾素反應模塊與幾個用轉(zhuǎn)錄因子 STAT1 和 IRF1 注釋的 SCENIC 調(diào)節(jié)子重疊绷蹲。
Defining cancer cell states by gene module expression
Having established the catalog of cancer gene modules, we next sought to understand how they are generally assembled at the level of individual cells（接下來試圖了解它們通常是如何在單個細胞水平上組裝的）. In particular, we asked whether cells are constrained in which modules or combinations of modules they can express. For this, we scored each malignant cell for the expression of each of the modules. In the SKSC Ji1 sample, for example,expression of basal, squamous and cycling modules was mutually exclusive, but each of these had co-expression with the stress or pEMT module. More generally, we found that most cells express a combination of modules, though not all combinations are possible. These results support the notion that, in defining a cancer cell state, it is crucial to examine the complete set of gene modules expressed（檢查表達的完整基因模塊集至關重要）。
由于模塊在癌癥類型中反復出現(xiàn)顾孽，推斷細胞模塊評分可以作為比較不同患者癌細胞的自然軸祝钢。最值得注意的是，該空間中的癌細胞不按患者或癌癥類型分組若厚，而是按其表達最高的模塊分組拦英。這與以下發(fā)現(xiàn)形成鮮明對比：在基因表達空間中，癌細胞按患者聚集测秸，并在去除個別基因引起的變異時突出癌癥類型的共性龄章。如 SKSC Ji1 所述，某些模塊之間存在一定程度的共表達：例如乞封，pEMT 與壓力和干擾素反應共表達做裙。連同細胞不形成不同簇的事實，這支持了癌細胞狀態(tài)通常不代表離散實體的觀點肃晚。然而锚贱，我們確實觀察到了與表達周期或纖毛模塊的細胞相對應的離散cluster。在基于基因表達的降維中單獨檢查腫瘤時关串，也會識別這些cluster拧廊，因此不是模塊得分降維的偽影。
由于某些模塊也存在于非癌癥樣本中晋修，我們query表達每個模塊的細胞比例是否在惡性和非惡性上皮之間有所不同吧碾。 為此，將惡性細胞中的模塊表達頻率與匹配樣本中的非惡性細胞中的模塊表達頻率進行了比較墓卦。 而對于 LUAD倦春、SKSC 和 THCA，我們與配對的相鄰正常樣本的上皮細胞進行了比較，而在 PDAC 中睁本，來自相同樣本的非惡性導管細胞用作配對的正常比較尿庐。
相對于正常，pEMT 模塊在所有三種癌癥類型中的表達頻率更高呢堰，這與 EMT 在上皮癌中的常見發(fā)生率一致抄瑟。 相對于正常，干擾素反應模塊在 LUAD 和 SKSC 中的表達頻率增加枉疼，但在 PDAC 中沒有變化皮假。 這可能部分解釋為用作參考的導管細胞是腫瘤本身的一部分，并暴露于 TME骂维。
正常肺和皮膚具有鱗狀成分钞翔，一致觀察到腫瘤樣品中鱗狀表達沒有差異。相比之下席舍，相對于正常導管細胞，在 PDAC 中誘導了鱗狀模塊哮笆，表明惡性細胞群中的鱗狀分化来颤。對于基礎模塊觀察到類似的趨勢〕碇猓基于bulk轉(zhuǎn)錄組學提出了幾種 PDAC 分類福铅，包括經(jīng)典亞型（腺體基因的高表達，包括 TFF1 和 CEACAM6）和基底亞型（鱗狀和基底基因的高表達项阴，包括 LY6D 和 KRT15）之間的區(qū)別滑黔。盡管鱗狀細胞胰腺癌很少見，但 PDAC 中鱗狀細胞表達頻率的增加表明部分化生向鱗狀細胞程序轉(zhuǎn)變是常見的环揽。 LUAD 和 PDAC 中腺體模塊的表達相對于它們的正常對應物沒有變化略荡，但相對于正常皮膚在 SKSC 中增加。這種模式表明歉胶，惡性細胞群保留與其細胞來源類型相關的模塊表達（例如汛兜，保留 SKSC 中的鱗狀模塊），并進一步部署來自其他細胞類型的基因模塊（增加 SKSC 中腺模塊的表達）通今。
Expression of the interferon response is modulated by the tumor microenvironment
癌細胞狀態(tài)可能反映了常見的物理限制以及與其微環(huán)境中細胞成分的相互作用粥谬。值得注意的是，免疫療法在一系列癌癥類型中的成功表明癌細胞和免疫細胞之間存在保守的相互作用辫塌，這讓我們質(zhì)疑與免疫系統(tǒng)的相互作用是否會影響發(fā)生的癌細胞狀態(tài)漏策。干擾素反應模塊尤其可能參與癌細胞和 TME 之間的相互作用。在腫瘤中臼氨，I 型干擾素由癌細胞和 DC 分泌掺喻，以響應 DNA 片段激活 cGAS/STING 通路，并導致 T 細胞啟動和抗腫瘤活性。 IFNγ 主要由適應性免疫細胞在激活時產(chǎn)生巢寡，并導致 MHC I 基因的上調(diào)喉脖，最初促進腫瘤排斥，但最終通過免疫編輯導致 IFN 無反應的腫瘤抑月。根據(jù)這些觀察树叽，我們query是否需要適應性免疫細胞來在體內(nèi)引發(fā)癌細胞中的干擾素反應模塊。為此谦絮，使用了已建立的同種異體移植小鼠癌癥模型题诵，其中 TME 很容易受到干擾。對四個原位胰腺腫瘤進行了 scRNA-Seq层皱，以驗證基因模塊可以在原位模型中重現(xiàn)性锭。像之前一樣使用 NMF 識別基因模塊，發(fā)現(xiàn)在這個系統(tǒng)中有五個被概括：循環(huán)叫胖、應激反應草冈、干擾素反應、缺氧和腺體分化瓮增。
同時怎棱，從 Rag1-/- 小鼠中形成的四種原位腫瘤中收集了 scRNA-Seq 數(shù)據(jù)，這些腫瘤缺乏 T 和 B 細胞绷跑。分析來自這些腫瘤的惡性細胞中的基因模塊表達拳恋，發(fā)現(xiàn)循環(huán)、應激反應砸捏、缺氧和腺體分化在 Rag1-/- 和 WT 小鼠之間以相似的頻率表達谬运。相比之下，干擾素反應模塊在來自 Rag1-/- 小鼠的腫瘤中以較低頻率表達（p < 10-10垦藏，Kolmogorov-Smirnov 檢驗）梆暖。此外，相對于其他癌細胞掂骏，干擾素反應模塊的所有基因在表達干擾素反應的細胞中都被上調(diào)式廷，這表明協(xié)調(diào)反應得以維持——盡管細胞較少。干擾素反應模塊的 MHC I 基因（B2m芭挽、H2-D1滑废、H2-K1）在 Rag1-/- 小鼠中總體表達較低（盡管它們在干擾素反應表達細胞中保持相對上調(diào)），表明淋巴細胞耗竭對 MHC I 基因的表達具有額外的一般影響袜爪，該基因不依賴于干擾素反應.
接下來測試了不同的腫瘤微環(huán)境是否也會調(diào)節(jié)干擾素反應模塊的表達蠕趁。 在一項實驗中，將胰腺中的原位腫瘤（癌癥的起源部位）與腹膜中的異位腫瘤（常見的轉(zhuǎn)移部位）進行了比較辛馆。 發(fā)現(xiàn)腹膜中的腫瘤具有較低頻率的干擾素反應表達細胞（在 Kolmogorov-Smirnov 檢驗中 p < 10-6）俺陋。 在第二個實驗中豁延，比較了兩個異位部位（腹膜和肝臟）的頻率，以模擬體內(nèi)不同的轉(zhuǎn)移部位腊状。 在這里诱咏，發(fā)現(xiàn)干擾素反應模塊在肝臟中的表達頻率高于腹膜（p < 10-10，Kolmogorov-Smirnov 檢驗）缴挖。
總的來說袋狞，這組實驗提供了對干擾素反應模塊在癌癥中出現(xiàn)的初步評估。 該模塊在各種癌癥類型映屋、器官和免疫環(huán)境中的存在表明苟鸯，惡性細胞間干擾素反應的異質(zhì)性是腫瘤的一個共同特征。 發(fā)現(xiàn)適應性免疫系統(tǒng)對于該模塊的大部分（但不是全部）表達是必要的棚点。 淋巴細胞耗盡狀態(tài)下的剩余表達表明癌細胞中干擾素反應的其他原因早处，無論是癌癥外源性，例如 NK 細胞分泌的干擾素瘫析，還是癌癥內(nèi)源性砌梆，與體外干擾素反應模塊的報告一致。 值得注意的是贬循，這一發(fā)現(xiàn)并沒有區(qū)分引發(fā)干擾素反應的信號機制和導致選擇腫瘤內(nèi)狀態(tài)的長期免疫編輯.
Spatial organization of malignant and non-malignant cell types in the tumor
為了進一步分析癌細胞狀態(tài)與 TME 細胞之間的組織和相互作用咸包，我們轉(zhuǎn)向基于測序的空間轉(zhuǎn)錄組學 (ST)。 與解離后獲得的 scRNA-Seq 不同——導致任何空間信息的丟失——基于陣列的 ST 數(shù)據(jù)不是以單細胞分辨率捕獲組織內(nèi)每個位置的 mRNA甘有，而是每個點捕獲約 10 個細胞。 因此葡缰，試圖通過整合十個腫瘤（OVCA NYU1亏掀、OVCA NYU3、UCEC NYU3泛释、BRCA NYU0滤愕、BRCA NYU1、BRCA NYU2怜校、PDAC NYU1间影、GIST NYU1、GIST NYU2茄茁、LIHC NYU1）的配對數(shù)據(jù)來利用這兩種模式的特性魂贬。 我們的 10 個腫瘤 ST 數(shù)據(jù)集中的每一個都由 6mm x 6mm 區(qū)域上的約 2,000 個點（范圍從 1,351 到 2,624）組成。 ST 陣列上的斑點相隔 100μm裙顽，使我們能夠深入了解腫瘤微環(huán)境付燥，例如，在這種距離下愈犹，旁分泌信號傳導功能键科。
由于每個點都是一種或多種細胞類型的細胞組合，因此其轉(zhuǎn)錄組可以表示為細胞類型轉(zhuǎn)錄組的加權總和。 為了推斷每個細胞類型在每個點的貢獻勋颖，使用來自配對單細胞數(shù)據(jù)的細胞類型的平均表達譜進行了非負線性最小二乘 (NNLS) 回歸（單細胞空間聯(lián)合）嗦嗡。 然后，將針對每種細胞類型獲得的系數(shù)與在隨機模型中獲得的系數(shù)進行比較饭玲，如果某個細胞的系數(shù)比隨機集中的平均值高出兩個以上的標準差侥祭，則認為該細胞存在于某個點。 團隊的病理學家（C.H. 和 D.F.D.）進一步驗證了這些注釋咱枉。 作為進一步分析的框架卑硫，我們根據(jù)細胞類型注釋將斑點分為三類：“惡性”，僅包含惡性細胞蚕断，“正郴斗”，僅包含免疫和基質(zhì)細胞亿乳，以及“兩者”硝拧，包含組合。
作為spot分類的獨立方法葛假，還直接比較了 10 個配對數(shù)據(jù)集的spot和單細胞轉(zhuǎn)錄組障陶。&&下圖 b 顯示了來自 OVCA NYU1 樣本的轉(zhuǎn)錄組的降維圖，灰色點表示 ST 點聊训，其他顏色表示單細胞轉(zhuǎn)錄組抱究，由注釋的細胞類型著色。通過調(diào)用相互最近鄰 (MNN) 集成和聯(lián)合降維带斑，發(fā)現(xiàn)來自兩種模態(tài)的數(shù)據(jù)很好地集成在一起鼓寺。單個細胞在外圍形成cluster，表明不同的細胞類型勋磕。 ST 點要么與單個單細胞cluster混合妈候，表示純種群，要么連接多個cluster挂滓，表示細胞類型的組合苦银。將 NNLS 方法確定的spot類別疊加到該圖上，始終觀察到“惡性”斑點與惡性細胞cluster混合赶站，“正翅Ｂ玻”spot位于非惡性細胞類型區(qū)域，“兩個”斑點跨越惡性和非惡性單細胞cluster贝椿。作為第二個例子所计，LIHC ST 數(shù)據(jù)集顯示了兩個空間不同的腫瘤結節(jié)，左側有大量惡性和非惡性細胞混合团秽，右側幾乎僅由惡性細胞組成主胧。聯(lián)合降維分析反映了兩個對應的惡性cluster叭首，在單獨考慮單細胞降維時沒有區(qū)別。該分析強調(diào)了整合成對的空間和單細胞數(shù)據(jù)集以將單個細胞錨定在其空間環(huán)境中的潛力踪栋。
為了進一步測試 NNLS 方法注釋斑點的準確性焙格，對兩個源自患者的黑色素瘤異種移植物 (PDX) 進行了配對的 scRNA-Seq 和 ST。 在這種情況下夷都，只有惡性細胞來自人類眷唉，因此表達人類基因，使我們能夠可靠地識別惡性細胞或斑點囤官。 在完整的小鼠和人類轉(zhuǎn)錄組上使用 NNLS 方法冬阳，我們首先為點身份建立了“基本事實”。 然后我們通過將小鼠基因轉(zhuǎn)換為人類直向同源物來模擬患者樣本党饮，從而去除物種信息肝陪。 以這種方式使用 NNLS 注釋斑點導致每個樣本的特異性分別為 99% 和 89%，支持其準確性刑顺。
Cancer cell state analysis of tumor cellular neighborhoods（空間臨近分析）
確定了每個腫瘤內(nèi)的惡性和非惡性細胞類型后氯窍，接下來試圖根據(jù)癌細胞狀態(tài)query細胞鄰域的組成。為此蹲堂，繪制了每個 ST 樣本中的癌細胞狀態(tài)狼讨，對每個“惡性”點的每個模塊的表達進行評分。為了確定這種評分方法的有效性柒竞，首先再次轉(zhuǎn)向 PDX 數(shù)據(jù)并對模塊表達的“惡性”點進行評分政供。由于在該系統(tǒng)中可以明確地區(qū)分人類惡性細胞與小鼠 TME 細胞，我們首先使用單細胞數(shù)據(jù)來確認模塊是由惡性細胞本身差異表達的朽基，并排除了由 TME 污染引起的偽影的可能性布隔。例如，pEMT 模塊包括通常由成纖維細胞表達的基因踩晶，但我們在惡性細胞中檢測到它的存在执泰。正如預期的那樣枕磁，干擾素反應模塊不存在渡蜻，因為與 Rag-/- 小鼠一樣，這些小鼠缺乏淋巴細胞计济。
為了表征每個“惡性”點周圍的細胞類型組成茸苇，計算了每種細胞類型的兩個分數(shù)指數(shù)，旨在捕捉它們的微環(huán)境沦寂。 將“鄰域分數(shù)”定義為包含該細胞類型的周圍斑點的分數(shù)学密。 因此，該分數(shù)直接測量相鄰點中的細胞類型組成传藏。 鄰近度得分衡量感興趣點與每種細胞類型的接近程度腻暮，并計算為到該類型細胞的最短距離的倒數(shù)彤守。
將每個腫瘤“惡性”點的模塊評分和細胞類型鄰域特征相關聯(lián)，揭示了 TME 的癌細胞狀態(tài)和細胞類型如何共同定位以形成“鄰域”哭靖。更密切地研究這種相關性證實了模塊評分和巨噬細胞鄰域評分之間這種正相關關系的重要性具垫。在使用接近度評分計算巨噬細胞的存在時，也觀察到了一致的關系试幽。為了探索所有樣本之間的這種關系筝蚕，我們計算了巨噬細胞鄰域的相關分數(shù)（±log10（p 值））。與干擾素反應的相關性在所有樣品中均呈正相關铺坞，10 個樣品中有 8 個顯著起宽。任何其他模塊都不是這種情況。這表明巨噬細胞可能會引發(fā)干擾素反應模塊的表達济榨，或者表達干擾素反應的癌細胞可能會募集巨噬細胞坯沪。事實上，最近的一項研究表明腿短，刺激腫瘤中的干擾素反應途徑會導致巨噬細胞的募集和激活屏箍。
使用鄰域和鄰近度量擴展對所有細胞類型和模塊對的分析，確定了細胞狀態(tài)與 TME 細胞類型的其他一致共定位橘忱。 除了巨噬細胞外赴魁，根據(jù)這兩種方法十减，表達干擾素反應的癌細胞與 T 細胞共定位烂叔，這與淋巴細胞導致干擾素反應增加的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一致。 需要進一步的工作來確定這些相互作用的模式和方向嘲更。 進行EMT的癌細胞與成纖維細胞和內(nèi)皮細胞呈正相關凝颇，與其他惡性細胞呈負相關潘拱，與在腫瘤界面富集并與癌相關成纖維細胞相互作用的發(fā)現(xiàn)一致。
Methods（關注一下重點方法）
Cell type annotation and detection of malignant cells
Non-negative matrix factorization (NMF) and module detection
Graph-based clustering and identification of consensus gene modules
SCENIC module identification and module comparison
Module expression scoring
Deconvolution of spatial transcriptomic spots.
Annotation of spatial transcriptomic spots
生活很好拧略，有你更好
