Gibson Assembly和Golden Gate Assembly這兩種方法都可用于無縫克隆，今天學(xué)習(xí)golden gateway。

每種基于限制酶的克隆方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)（pluses and minuses），但是Golden Gate 克隆在合成生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域都很有用熊尉，下面介紹如何在克隆時運(yùn)用這個準(zhǔn)確且易于使用的系統(tǒng)跷跪。

Golden Gate 克隆技術(shù)依賴于1996年首次發(fā)現(xiàn)的IIS型限制酶，辐啄。IIS型限制酶和傳統(tǒng)的限制酶不同，其切割位點(diǎn)和識別位點(diǎn)不同运嗜，會在識別序列外切割出4個堿基的粘性末端壶辜，因此可以定制切割序列，如果設(shè)計(jì)成功的話担租，識別位點(diǎn)不會出現(xiàn)在最后的載體中砸民，可以完成準(zhǔn)確的無縫克隆。

克隆計(jì)劃如下：在目的基因切割位點(diǎn)外設(shè)計(jì)IIS型限制酶（BsaI或BbsI）識別位點(diǎn)奋救，酶切連接后該識別位點(diǎn)被消除岭参，不會出現(xiàn)在最后的載體中；載體上含有與目的基因的切割位點(diǎn)互補(bǔ)的突出末端尝艘，可以指導(dǎo)連接演侯。

如下圖所示，含有相同突出末端的目的片段和載體相連接背亥。Entry DNA的突出末端序列可能存在于原始質(zhì)粒上（Option 1）或者通過PCR擴(kuò)增添加（Option 2）秒际。

01Golden Gate克隆的優(yōu)點(diǎn)

1、時間短：Golden Gate克隆就實(shí)驗(yàn)時間而言是最簡單的克隆方法狡汉，因?yàn)槊盖泻瓦B接在一個30min的反應(yīng)中即可完成娄徊。

2、效率高：destination載體和entry載體被添加在一個含有IIS型限制酶和連接酶的管中盾戴，雖然原始的destination載體和插入片段還可以自連接寄锐，但是由于仍含有IIS型限制酶識別位點(diǎn)，所以還會被酶切；而成功的連接產(chǎn)物不再含有酶切識別位點(diǎn)橄仆，所以連接效率接近100%剩膘。

3、可連接的片段多：4個堿基的特異性末端能用來連接多個片段——可以在一個反應(yīng)中連接多達(dá)10個片段沿癞。不同的突出末端可以確定片段的連接順序援雇，連接后限制酶識別位點(diǎn)的消失有利于成功連接矛渴。雖然隨著DNA片段數(shù)量的增加或者片段非常小或大椎扬，效率會降低，這些問題可以通過篩選更多的單克隆得以解決具温。

Golden Gate連接相比其它克隆方法有一些優(yōu)點(diǎn)：

基于核酸外切酶的方法如Gibson連接蚕涤，DNA片段末端需要20-40bp的同源序列確定連接順序，所以若目的片段本身的5'或3'末端含有同源序列則不能用此法連接铣猩，但可用Golden Gate克隆揖铜。

使用Gateway 克隆系統(tǒng)會產(chǎn)生含有一個編碼8個氨基酸的attB重組痕跡的結(jié)構(gòu)，但是Golden Gate連接能設(shè)計(jì)成無痕的达皿，并且比許多商業(yè)化的克隆方法都要便宜天吓。

02Golden Gate和合成生物學(xué)

合成生物學(xué)已經(jīng)將Golden Gate克隆方法用在了分子克隆策略中，有時稱其為MoClo峦椰，這個策略利用了IIS型限制酶BsaI和BpiI/BbsI可一次性有效組裝多達(dá)6個片段的特點(diǎn)龄寞。和所有基于Golden Gate的方法一樣，該系統(tǒng)也利用了IIS型限制酶切割識別位點(diǎn)外的序列汤功，并且允許含有相同突出末端的DNA片段組裝的能力物邑。通過設(shè)計(jì)獨(dú)一無二的限制酶切割位點(diǎn)可以幫助DNA片段按順序連接，這就可以幫助多個DNA組分（啟動子滔金、基因色解、終止子等）在一個反應(yīng)中準(zhǔn)確連接。

03Golden Gate和基因工程

2011年餐茵，Bogdanove和Voytas團(tuán)隊(duì)描述了一種新的基于Golden Gate的基因編輯技術(shù)科阎，該技術(shù)可通過多個DNA片段的有序組裝來構(gòu)建TALEN（類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶）。使用這些可利用限制酶BsaI和BsmBI的質(zhì)粒忿族，可以在幾步內(nèi)快速有效地構(gòu)建TAL序列锣笨。

CRISPR技術(shù)也運(yùn)用了Golden Gate克隆，在含Cas9序列的質(zhì)粒中插入合適的gRNA低聚核苷酸靶序列肠阱，這不僅使連接一個gRNA變得簡單票唆，也可連接多達(dá)7個gRNA。

04Golden Gate的缺點(diǎn)

Golden Gate并非100%不依賴于序列屹徘，為避免預(yù)料之外的酶切走趋，IIS型限制酶識別位點(diǎn)不能存在于所連接的片段內(nèi)部。解決這個問題的方法是改造目的片段噪伊，通過PCR擴(kuò)增在片段內(nèi)識別位點(diǎn)上創(chuàng)造沉默的點(diǎn)突變簿煌，用IIS型限制酶特異性酶切PCR產(chǎn)物并在退火步驟后得以連接氮唯。如果目的基因和destination載體內(nèi)部含有多個限制位點(diǎn)則有可能不能改造，需要考慮使用Gateway克隆或者Gibson連接姨伟。

另一個需要注意的是粘性末端的設(shè)計(jì)惩琉，雖然理論上可以有256種不同的切割序列，但是只通過一個不同的堿基區(qū)分不同的序列可能會產(chǎn)生錯誤的產(chǎn)物夺荒。

不管用于上述何種應(yīng)用瞒渠，Golden Gate克隆無疑是一種能在一個簡單且高效的步驟中完成克隆復(fù)雜載體的強(qiáng)大工具。