嬰兒癲癇綜合征大鼠模型再現(xiàn)臨床特征【NEPA 21在腦神經(jīng)疾病動物模型構(gòu)建中的應(yīng)用】
Dravet綜合征（Dravet syndrome, DS），又稱嬰兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇，是一種常在嬰兒期出現(xiàn)癥狀的發(fā)育性及癲癇性腦神經(jīng)疾病。該病主要特征是早期出現(xiàn)由高溫引起的癲癇發(fā)作导坟，通常發(fā)生在出生后的第一年魔种，患者不僅會出現(xiàn)行為和運(yùn)動障礙，還會出現(xiàn)認(rèn)知發(fā)育遲緩冷守。研究表明，導(dǎo)致DS的主要原因是編碼鈉離子通道Nav1.1的SCN1A基因的雜合功能的缺失有關(guān)惊科。Nav1.1密度的降低破壞了神經(jīng)元的興奮性拍摇，中間神經(jīng)元的去抑制作用增加了興奮/抑制比（E/I比率），科學(xué)家認(rèn)為與退行性椎體滑移的病理生理有關(guān)馆截。為了超越目前的對癥治療技術(shù)充活，研究人員正在構(gòu)建DS動物模型以及研發(fā)幾種基因治療方案，目的是恢復(fù)DS動物模型中的E/I比率從而實(shí)現(xiàn)基因治療方案去治療DS蜡娶。
近年來混卵，盡管在臨床前動物模型中已經(jīng)產(chǎn)生了幾種退行性椎體滑移的小鼠模型，為研究疾病機(jī)制和測試治療干預(yù)措施提供了寶貴的機(jī)會窖张，但成功轉(zhuǎn)化為基因治療退行性椎體滑移仍然是一個遙遠(yuǎn)的目標(biāo)幕随。基因治療和對癥治療方法主要在新生或幼年小鼠中進(jìn)行探索宿接，然而對于它們在整個成年期的長期療效和安全性知之甚少赘淮，因此迫切需要一種有效的動物模型，以便在整個生命周期內(nèi)進(jìn)行后續(xù)研究澄阳。大鼠（Rattus Norvegicus）作為基礎(chǔ)和臨床前研究中受歡迎的動物模型拥知，被認(rèn)為是癲癇研究的可靠物種，同時大多數(shù)癲癇模型最初都是在大鼠身上建立碎赢，特別是隨著近年來基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展低剔，轉(zhuǎn)基因大鼠在腦神經(jīng)疾病科學(xué)研究中更倍受重視。
近日肮塞，中科院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院腦認(rèn)知與腦疾病研究所王虹課題組在知名期刊Neurobiology of Disease發(fā)表了題為“A novel rat modelof Dravet syndrome recapitulates clinical hallmarks”的研究論文襟齿，報(bào)道了通過大鼠輸卵管電轉(zhuǎn)染基因編輯技術(shù)（i-GONAD）成功構(gòu)建了Scn1a基因突變大鼠模型。通過深入表型分析枕赵，該轉(zhuǎn)基因大鼠模型高度擬合DS癥患者發(fā)熱猜欺、驚厥等系列癥狀，同時DS大鼠存活至成年拷窜，使其成為跟蹤疾病進(jìn)展开皿、評估治療干預(yù)措施及開發(fā)DS基因治療方案的有效臨床前模型涧黄。
在本實(shí)驗(yàn)中，作者通過將CRISPR-Cas9及RNP復(fù)合物注入到孕鼠輸卵管壺腹處赋荆，并采用NEPA 21電轉(zhuǎn)染儀（NEPA GENE）進(jìn)行體內(nèi)受精卵電轉(zhuǎn)染笋妥，兩次電轉(zhuǎn)染手術(shù)共產(chǎn)生22只活幼鼠，其中12只成功實(shí)現(xiàn)Scn1a基因敲除（KO）以及另一個等位基因的突變（圖1）窄潭。
圖1春宣、基于i-GONAD 技術(shù)生成Scn1a+/?大鼠
通過培養(yǎng)雜合子Scn1a+/?大鼠，獲得了三種基因型:野生型（WT）嫉你、Scn1a+/?和Scn1a?/?（KO）月帝，并采用Mantel-Cox檢驗(yàn)、原位雜交等技術(shù)檢測了大鼠腦中Scn1a和mRNA的水平幽污，結(jié)果顯示與WT大鼠相比嚷辅，Scn1a+/?大鼠的大腦（包括皮質(zhì)、海馬和丘腦）中Scn1a基因的表達(dá)減少距误，同時在mRNA水平上Scn1a表達(dá)的減少表明Scn1a+/?大鼠代表了Dravet綜合征的單倍體功能不全模型（圖2）潦蝇。
圖2、Scn1a突變大鼠的基因深寥、mRNA、發(fā)育及行為檢測
退行性椎體滑移的臨床特征是患者在出生后一年內(nèi)出現(xiàn)高熱誘發(fā)的癲癇發(fā)作贤牛，因此作者選擇對幼鼠進(jìn)行研究惋鹅，以評估它們對高溫誘發(fā)癲癇發(fā)作的易感性。值得注意的是殉簸，100%的WT大鼠保持無癲癇發(fā)作闰集，而100%的Scn1a+/?大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重癲癇發(fā)作，Scn1a+/?大鼠對熱致癲癇發(fā)作非常敏感般卑，這是Dravet綜合征的一個核心特征（圖3）武鲁。因此，我們將Scn1a+/?大鼠稱為DS大鼠蝠检。
圖3沐鼠、在熱誘導(dǎo)過程中，DS大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的高溫誘發(fā)癲癇發(fā)作
同時腦電記錄（EEG）和行為學(xué)分析實(shí)驗(yàn)揭示雜合突變體Scn1a+/?大鼠在體溫升高時叹谁，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的癲癇行為饲梭，如抽搐、肌肉痙攣焰檩、身子僵直等憔涉，與Dravet綜合癥患者在發(fā)熱后發(fā)作出現(xiàn)驚厥癥狀一致。在首發(fā)熱驚厥后析苫，雜合突變Scn1a+/?大鼠顯示出頻繁的自發(fā)癲癇發(fā)作兜叨，與患者腦電特征高度擬合（圖4）穿扳。
圖4、DS大鼠在高溫誘發(fā)癲癇發(fā)作及隨后自發(fā)性癲癇發(fā)作時的癲癇樣腦電圖（EEG）活動
總之国旷，CRISPR-Cas9技術(shù)極大地?cái)U(kuò)展了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的潛力矛物，輸卵管電轉(zhuǎn)染技術(shù)（i-GONAD）的發(fā)明進(jìn)一步簡化了這一過程，利用這一技術(shù)议街，在本研究中研究人員成功敲除Scn1a等位基因泽谨，基因編輯效率高達(dá)75%，與之前的一篇論文（Kobayashi et al, 2020）一致特漩，該雜合突變體Scn1a+/?大鼠在基因表達(dá)以及表型水平均高度擬合Dravet綜合癥患者吧雹，該DS大鼠模型成功的構(gòu)建為后續(xù)DS的基因治療策略的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。同時作者證實(shí)了當(dāng)NEPA 21電轉(zhuǎn)染儀在電轉(zhuǎn)過程中施加約350 mA的電流時涂身，基因組編輯的效果最佳雄卷。此外，由于F1代Scn1a+/?大鼠無需預(yù)測脫靶效應(yīng)蛤售，無需與野生型SD大鼠進(jìn)行多代雜交就可以進(jìn)行表型分析丁鹉，因此i-GONAD技術(shù)也很節(jié)省時間、高效悴能。
NEPA21(NEPA Gene)應(yīng)用于懸浮轉(zhuǎn)染（免疫細(xì)胞揣钦、干細(xì)胞等各種難轉(zhuǎn)染細(xì)胞，類器官漠酿、外泌體等）冯凹；貼壁轉(zhuǎn)染；離體組織轉(zhuǎn)染（受精卵炒嘲、器官等）宇姚；活體轉(zhuǎn)染（腦、視網(wǎng)膜夫凸、肌肉浑劳、肝臟等）等領(lǐng)域。針對難轉(zhuǎn)染細(xì)胞夭拌、組織或活體魔熏，提供全套轉(zhuǎn)染解決方案。
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??原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.nbd.2023.106193
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