生信小課堂
本文的思路是通過WGCNA分析識別了某種免疫細胞相關(guān)的marker基因抱环，然后利用這些基因進行預(yù)后模型的構(gòu)建壳快。事實上，預(yù)后模型的文章已經(jīng)不好發(fā)了镇草，甚至有的審稿人看到預(yù)后模型就反感眶痰，因為實在是太多了，而且預(yù)測效能普遍不行梯啤。那么如何做的比這篇文章還要好呢竖伯？鑒于最近泛癌分析以及腫瘤分型分析比較好發(fā)，小編做的免疫細胞marker的泛癌分析以及腫瘤分型条辟，內(nèi)容是這些文章的2倍以上黔夭，均發(fā)表到8+雜志宏胯。所以我們在結(jié)合單細胞分析篩選某種免疫細胞特有的marker基因羽嫡，對這些基因進行泛癌分析或者腫瘤分型分析。在分型分析中再附上簡單的預(yù)后模型肩袍，但不以其為重點杭棵。這樣的思路肯定是比本篇文章內(nèi)容更多，更新穎。如果想做類似分析魂爪，歡迎交流先舷。
研究背景：
黑色素瘤是一種具有早期轉(zhuǎn)移的高度侵襲性皮膚癌，在皮膚癌中死亡率最高滓侍。盡管最近新輔助免疫治療蒋川、化療和靶向治療的進展改善了患者的預(yù)后，但許多患者只能獲得暫時的緩解撩笆，并最終產(chǎn)生治療耐藥捺球。骨髓來源的細胞穿透腫瘤并分化成被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)的巨噬細胞，它是腫瘤充氣白細胞的主要成分夕冲。為了對黑色素瘤患者中M2-like TAM浸潤的分子特征提供新的認識氮兵，基于皮膚黑色素瘤(TCGA-SKCM)數(shù)據(jù)集中與M2-like TAM浸潤最相關(guān)的基因模塊確定了兩個不同的聚類(Cluster 1和Cluster 2)。VARS1被認為是與M2-like TAM浸潤最相關(guān)的模塊的樞紐基因歹鱼，這表明VARS1與TAM極化可能是黑色素瘤發(fā)展的一個新的潛在靶點泣栈。
研究結(jié)果：
一、M2的TAM相關(guān)基因模塊的識別
1弥姻、在TCGA和GSE98394數(shù)據(jù)集中南片，作者使用CIBERSORT 算法評估M2巨噬細胞浸潤比例，并發(fā)現(xiàn)M2巨噬細胞浸潤比例較高的患者預(yù)后較差(圖1a)庭敦。
2铃绒、接著作者使用WGCNA方法，識別與M2細胞浸潤相關(guān)的基因模塊螺捐。熱圖顯示颠悬，在TCGA-SKCM中，黃色模塊與CD8 + T細胞和M2巨噬細胞的浸潤分別呈負相關(guān)和正相關(guān)(圖1B)定血。
3赔癌、作者隨后通過單因素回歸分析篩選到125個與OS相關(guān)的基因±焦担基于125個預(yù)后基因灾票，使用R ConsensusClusterPlus包對TCGA-SKCM數(shù)據(jù)集進行一致聚類，并確定了兩個聚類:聚類1(319例)和聚類2(148例)(圖1 C)茫虽。
4刊苍、Cluster 1的OS結(jié)果比Cluster 2更差(log-rank p = 0.0071，圖1D)濒析。
二正什、功能和多組學(xué)分析
1、圖2A描述了每個集群中富集的前20條路徑号杏。
2婴氮、與簇2相比，簇1包含更高比例的角蛋白亞型(57% vs. 13%)和更低比例的免疫亞型(34.7% vs. 56.2%)(圖2B)。GSEA顯示主经，M2巨噬細胞通路在聚類1中富集(圖2C)荣暮。免疫檢查點基因的差異表達檢測顯示，與聚類1相比罩驻，聚類2的免疫檢查點相關(guān)基因表達更高(圖2D)穗酥。
3、研究每個集群中的突變惠遏，用瀑布圖突出顯示了兩個集群中最顯著突變的前20個基因(SMGs)(圖3A, 3B)迷扇。
4、簇1共包含56個焦點缺失峰和69個焦點放大峰爽哎，簇2包含37個焦點缺失峰和28個焦點放大峰(圖4A, 4B)蜓席。
5、使用R ChAMP包與FDR 分析兩個簇間甲基化差異课锌，得到簇1和簇2間差異甲基化探針(DMPs) 28,870個厨内。簇1的CD8A和HAVCR2的甲基化水平比簇2高(圖4C)。
三渺贤、M2巨噬細胞簇相關(guān)預(yù)后模型的構(gòu)建
1雏胃、研究了兩個類群之間的差異基因，基于單基因回歸分析--Lasso回歸分析--多因素回歸分析志鞍，構(gòu)建了預(yù)后模型(圖5A)瞭亮。
2、風(fēng)險評分越高的患者OS預(yù)后越差固棚，Cluster 1患者風(fēng)險評分越高(圖5B-C)统翩。
3、AUC表明此洲，M2巨噬細胞集群相關(guān)風(fēng)險評分在預(yù)測TCGA數(shù)據(jù)集中黑色素瘤患者的OS方面具有潛在價值(圖5D)厂汗。
4、為了驗證模型的預(yù)后意義呜师，在一個驗證隊列(GSE65904)中使用相同的模型評分閾值計算風(fēng)險評分娶桦，結(jié)果相似，風(fēng)險評分越高的患者OS越差汁汗，風(fēng)險評分具有預(yù)后價值(圖5E-F)衷畦。
四、高危組與低危組免疫細胞浸潤和免疫基因表達的差異
1知牌、高危組與低危組免疫細胞浸潤的比較（圖5G）祈争。
2、與TCGA數(shù)據(jù)集的低風(fēng)險評分組相比送爸，高風(fēng)險評分組的抗原遞呈和免疫檢查點相關(guān)基因的表達明顯增加(圖6A-C)铛嘱。
3、為了進一步觀察高風(fēng)險評分組和低風(fēng)險評分組對免疫治療反應(yīng)的差異袭厂，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險評分組對免疫治療無反應(yīng)的比例高于低風(fēng)險評分組(64%：28%)墨吓。(圖6 D)。
五纹磺、VARS1作為黃色模塊的樞紐基因及其在黑色素瘤進展和巨噬細胞極化中的作用
1帖烘、維恩圖顯示M2相關(guān)模塊的樞紐基因與DepMap數(shù)據(jù)庫中對黑色素瘤人類細胞系生長至關(guān)重要的基因的交集，通過與四種PPI識別hub基因方法獲得的基因集進行交集橄杨，得到VARS1(圖7 A)秘症。
2、在TCGA數(shù)據(jù)集中式矫，高VARS1表達與較短的OS相關(guān)(圖7B)乡摹。
3、GSE115978數(shù)據(jù)集的單細胞RNA-seq結(jié)果顯示采转，VARS1主要在腫瘤細胞中表達聪廉，而不在基質(zhì)細胞和免疫細胞中表達(圖7C)。
4故慈、過表達VARS1促進了細胞的遷移和侵襲能力板熊，而抑制VARS1則顯著降低了這種能力(圖7D-F)。
5察绷、GSEA表明干签，在TCGA-SKCM數(shù)據(jù)集中，高VARS1水平與轉(zhuǎn)移相關(guān)通路呈正相關(guān)(圖7G)拆撼。
六容劳、VARS1與免疫浸潤和誘導(dǎo)的M2巨噬細胞極化呈負相關(guān)
1、KEGG通路顯示闸度，在VARS1低表達的患者中鸭蛙，免疫相關(guān)通路如T細胞受體通路富集，而在VARS1高表達的患者中筋岛，腫瘤生長通路如細胞周期通路和mTOR通路富集(圖8 A)娶视。
2、VARS1表達與腫瘤內(nèi)M2巨噬細胞浸潤呈正相關(guān)睁宰，與M1巨噬細胞浸潤和CD8T細胞浸潤呈負相關(guān)(圖8B-C)肪获。
3、流式細胞術(shù)顯示柒傻，與載體a375上清處理的THP1細胞相比孝赫，使用VARS1-A375上清處理的THP1細胞中M2巨噬細胞標志物CD206的表達增加了3倍，而M1巨噬細胞標志物CD86的表達減少了15.2%(圖8D)红符。
七青柄、高VARS1表達與低CD8 T細胞浸潤相關(guān)伐债，預(yù)測免疫檢查點封鎖的臨床效果差
1、在TCGA-SKCM數(shù)據(jù)集中致开，VARS1的高表達與CD8T細胞浸潤呈負相關(guān)(圖9A)峰锁。
2、在TCGA和GSE65904數(shù)據(jù)集中双戳，許多免疫檢查點基因的表達與VARS1的表達呈負相關(guān)(圖9B)虹蒋。
3、VARS1的低表達預(yù)示著對抗pd -1免疫治療的部分應(yīng)答(PR)飒货，而VARS1的高表達預(yù)示著對抗pd -1免疫治療的耐藥(SD)(圖9C)魄衅。
總結(jié)：黑素瘤被認為是最具侵襲性的皮膚癌類型，對免疫治療特別敏感塘辅，例如使用CTLA4和PD-1拮抗劑進行免疫檢查點封鎖晃虫。免疫治療可以明顯改善患者的預(yù)后，特別是對于IV期黑色素瘤患者扣墩，但一旦患者產(chǎn)生免疫治療耐藥性傲茄，死亡率將變得相當(dāng)高。盡管如此沮榜，解決和預(yù)測黑色素瘤免疫治療反應(yīng)的目標已經(jīng)達到盘榨。考慮到大量研究已經(jīng)證明了TAMs在黑色素瘤的臨床結(jié)果和免疫治療耐藥中的重要性蟆融，本研究應(yīng)用WGCNA首次識別了黑色素瘤中一個M2樣TAM模塊草巡，并檢驗了M2樣TAMs作為黑色素瘤預(yù)后標志物和預(yù)測免疫治療反應(yīng)的可靠性。
