本文的思路是通過(guò)WGCNA分析識(shí)別了某種免疫細(xì)胞相關(guān)的marker基因炫贤，然后利用這些基因進(jìn)行預(yù)后模型的構(gòu)建。事實(shí)上付秕，預(yù)后模型的文章已經(jīng)不好發(fā)了兰珍，甚至有的審稿人看到預(yù)后模型就反感，因?yàn)閷?shí)在是太多了询吴，而且預(yù)測(cè)效能普遍不行掠河。那么如何做的比這篇文章還要好呢？鑒于最近泛癌分析以及腫瘤分型分析比較好發(fā)猛计，小編做的免疫細(xì)胞marker的泛癌分析以及腫瘤分型唠摹，內(nèi)容是這些文章的2倍以上，均發(fā)表到8+雜志奉瘤。
所以我們?cè)诮Y(jié)合單細(xì)胞分析篩選某種免疫細(xì)胞特有的marker基因勾拉，對(duì)這些基因進(jìn)行泛癌分析或者腫瘤分型分析煮甥。在分型分析中再附上簡(jiǎn)單的預(yù)后模型，但不以其為重點(diǎn)藕赞。這樣的思路肯定是比本篇文章內(nèi)容更多成肘，更新穎。如果想做類似分析斧蜕，歡迎交流双霍。
研究背景：
黑色素瘤是一種具有早期轉(zhuǎn)移的高度侵襲性皮膚癌，在皮膚癌中死亡率最高批销。盡管最近新輔助免疫治療洒闸、化療和靶向治療的進(jìn)展改善了患者的預(yù)后，但許多患者只能獲得暫時(shí)的緩解均芽，并最終產(chǎn)生治療耐藥丘逸。骨髓來(lái)源的細(xì)胞穿透腫瘤并分化成被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)的巨噬細(xì)胞，它是腫瘤充氣白細(xì)胞的主要成分骡技。為了對(duì)黑色素瘤患者中M2-like TAM浸潤(rùn)的分子特征提供新的認(rèn)識(shí)鸣个，基于皮膚黑色素瘤(TCGA-SKCM)數(shù)據(jù)集中與M2-like TAM浸潤(rùn)最相關(guān)的基因模塊確定了兩個(gè)不同的聚類(Cluster 1和Cluster 2)。VARS1被認(rèn)為是與M2-like TAM浸潤(rùn)最相關(guān)的模塊的樞紐基因布朦，這表明VARS1與TAM極化可能是黑色素瘤發(fā)展的一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)囤萤。
研究結(jié)果：
一、M2的TAM相關(guān)基因模塊的識(shí)別
1是趴、在TCGA和GSE98394數(shù)據(jù)集中涛舍，作者使用CIBERSORT 算法評(píng)估M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)比例，并發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)比例較高的患者預(yù)后較差(圖1a)唆途。
2富雅、接著作者使用WGCNA方法，識(shí)別與M2細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的基因模塊肛搬。熱圖顯示没佑，在TCGA-SKCM中，黃色模塊與CD8 + T細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)分別呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)(圖1B)温赔。
3蛤奢、作者隨后通過(guò)單因素回歸分析篩選到125個(gè)與OS相關(guān)的基因√赵簦基于125個(gè)預(yù)后基因啤贩，使用R ConsensusClusterPlus包對(duì)TCGA-SKCM數(shù)據(jù)集進(jìn)行一致聚類，并確定了兩個(gè)聚類:聚類1(319例)和聚類2(148例)(圖1 C)拜秧。
4痹屹、Cluster 1的OS結(jié)果比Cluster 2更差(log-rank p = 0.0071，圖1D)枉氮。
二志衍、功能和多組學(xué)分析
1暖庄、圖2A描述了每個(gè)集群中富集的前20條路徑。
2足画、與簇2相比雄驹，簇1包含更高比例的角蛋白亞型(57% vs. 13%)和更低比例的免疫亞型(34.7% vs. 56.2%)(圖2B)。GSEA顯示淹辞，M2巨噬細(xì)胞通路在聚類1中富集(圖2C)医舆。免疫檢查點(diǎn)基因的差異表達(dá)檢測(cè)顯示，與聚類1相比象缀，聚類2的免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因表達(dá)更高(圖2D)蔬将。
3、研究每個(gè)集群中的突變央星，用瀑布圖突出顯示了兩個(gè)集群中最顯著突變的前20個(gè)基因(SMGs)(圖3A, 3B)霞怀。
4、簇1共包含56個(gè)焦點(diǎn)缺失峰和69個(gè)焦點(diǎn)放大峰莉给，簇2包含37個(gè)焦點(diǎn)缺失峰和28個(gè)焦點(diǎn)放大峰(圖4A, 4B)毙石。
5、使用R ChAMP包與FDR 分析兩個(gè)簇間甲基化差異颓遏，得到簇1和簇2間差異甲基化探針(DMPs) 28,870個(gè)徐矩。簇1的CD8A和HAVCR2的甲基化水平比簇2高(圖4C)。
三叁幢、M2巨噬細(xì)胞簇相關(guān)預(yù)后模型的構(gòu)建
1滤灯、研究了兩個(gè)類群之間的差異基因，基于單基因回歸分析--Lasso回歸分析--多因素回歸分析曼玩，構(gòu)建了預(yù)后模型(圖5A)鳞骤。
2、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分越高的患者OS預(yù)后越差黍判，Cluster 1患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分越高(圖5B-C)豫尽。
3、AUC表明顷帖，M2巨噬細(xì)胞集群相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在預(yù)測(cè)TCGA數(shù)據(jù)集中黑色素瘤患者的OS方面具有潛在價(jià)值(圖5D)拂募。
4、為了驗(yàn)證模型的預(yù)后意義窟她，在一個(gè)驗(yàn)證隊(duì)列(GSE65904)中使用相同的模型評(píng)分閾值計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，結(jié)果相似蔼水，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分越高的患者OS越差震糖，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分具有預(yù)后價(jià)值(圖5E-F)。
四趴腋、高危組與低危組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫基因表達(dá)的差異
1吊说、高危組與低危組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的比較（圖5G）论咏。
2、與TCGA數(shù)據(jù)集的低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組相比颁井，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組的抗原遞呈和免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)明顯增加(圖6A-C)厅贪。
3、為了進(jìn)一步觀察高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組和低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組對(duì)免疫治療反應(yīng)的差異雅宾，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組對(duì)免疫治療無(wú)反應(yīng)的比例高于低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組(64%：28%)养涮。(圖6 D)。
五眉抬、VARS1作為黃色模塊的樞紐基因及其在黑色素瘤進(jìn)展和巨噬細(xì)胞極化中的作用
1贯吓、維恩圖顯示M2相關(guān)模塊的樞紐基因與DepMap數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)黑色素瘤人類細(xì)胞系生長(zhǎng)至關(guān)重要的基因的交集，通過(guò)與四種PPI識(shí)別hub基因方法獲得的基因集進(jìn)行交集蜀变，得到VARS1(圖7 A)悄谐。
2、在TCGA數(shù)據(jù)集中库北，高VARS1表達(dá)與較短的OS相關(guān)(圖7B)爬舰。
3、GSE115978數(shù)據(jù)集的單細(xì)胞RNA-seq結(jié)果顯示寒瓦，VARS1主要在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)情屹，而不在基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞中表達(dá)(圖7C)。
4孵构、過(guò)表達(dá)VARS1促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力屁商，而抑制VARS1則顯著降低了這種能力(圖7D-F)。
5颈墅、GSEA表明蜡镶，在TCGA-SKCM數(shù)據(jù)集中，高VARS1水平與轉(zhuǎn)移相關(guān)通路呈正相關(guān)(圖7G)恤筛。
六官还、VARS1與免疫浸潤(rùn)和誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞極化呈負(fù)相關(guān)
1、KEGG通路顯示毒坛，在VARS1低表達(dá)的患者中望伦，免疫相關(guān)通路如T細(xì)胞受體通路富集，而在VARS1高表達(dá)的患者中煎殷，腫瘤生長(zhǎng)通路如細(xì)胞周期通路和mTOR通路富集(圖8 A)屯伞。
2、VARS1表達(dá)與腫瘤內(nèi)M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)豪直，與M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和CD8T細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)(圖8B-C)劣摇。
3、流式細(xì)胞術(shù)顯示弓乙，與載體a375上清處理的THP1細(xì)胞相比末融，使用VARS1-A375上清處理的THP1細(xì)胞中M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206的表達(dá)增加了3倍钧惧，而M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86的表達(dá)減少了15.2%(圖8D)。
七勾习、高VARS1表達(dá)與低CD8 T細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)浓瞪，預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)封鎖的臨床效果差
1、在TCGA-SKCM數(shù)據(jù)集中巧婶，VARS1的高表達(dá)與CD8T細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)(圖9A)乾颁。
2、在TCGA和GSE65904數(shù)據(jù)集中粹舵，許多免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)與VARS1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖9B)钮孵。
3、VARS1的低表達(dá)預(yù)示著對(duì)抗pd -1免疫治療的部分應(yīng)答(PR)眼滤，而VARS1的高表達(dá)預(yù)示著對(duì)抗pd -1免疫治療的耐藥(SD)(圖9C)巴席。
總結(jié)：黑素瘤被認(rèn)為是最具侵襲性的皮膚癌類型，對(duì)免疫治療特別敏感诅需，例如使用CTLA4和PD-1拮抗劑進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)封鎖漾唉。免疫治療可以明顯改善患者的預(yù)后，特別是對(duì)于IV期黑色素瘤患者堰塌，但一旦患者產(chǎn)生免疫治療耐藥性赵刑，死亡率將變得相當(dāng)高。盡管如此场刑，解決和預(yù)測(cè)黑色素瘤免疫治療反應(yīng)的目標(biāo)已經(jīng)達(dá)到般此。考慮到大量研究已經(jīng)證明了TAMs在黑色素瘤的臨床結(jié)果和免疫治療耐藥中的重要性牵现，本研究應(yīng)用WGCNA首次識(shí)別了黑色素瘤中一個(gè)M2樣TAM模塊铐懊，并檢驗(yàn)了M2樣TAMs作為黑色素瘤預(yù)后標(biāo)志物和預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)的可靠性。
