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篇一：引物設(shè)計原則
剛做實驗的同學(xué)脯宿，很多時候希望別人幫自己設(shè)計好引物话告，其實這種方式是不可取的兼搏，首先是高估了引物設(shè)計 的難度，其次也自己的實驗別人了解的并不多沙郭，還有就是引物設(shè)計 其實是實驗者必備的技能佛呻。這里講述下RT-PCR 設(shè)計的基本原則。
1.上下游引物要保守：
為了能夠擴增出所需要的保守片段病线，必須對保守的100-200片段進行PCR擴增吓著。所以引物的選取也要非常的保守，最好不要有不同的堿基送挑，若不得不有時绑莺，也必須保證引物的3’端至少有4個堿基是完全保守才可。
在設(shè)計保守引物時惕耕，要在發(fā)表序列上分別找保守一致的區(qū)域纺裁，即在發(fā)表序列的5’端引物位置找的是3’端至少有5個bp保守，在即在發(fā)表序列的3’端引物位置找的是5’端至少有5個bp保守赡突。
5’NNNNNNN 3’
發(fā)表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’NNNNNNNNN 5’
2. 上下游引物的長度和Tm值：
上下游引物的長度一般為18-25bp之間对扶，且Tm值在58-60℃之間区赵。確保引物中GC含量在30-80%惭缰。應(yīng)避免引物中多個重復(fù)的堿基出現(xiàn)浪南，尤其是要避免4個或超過4個的G堿基出現(xiàn)。引物的3’端最好不為G或/和C漱受。引物3’端的5個堿基不應(yīng)出現(xiàn)2個G或/和C络凿。
上游引物應(yīng)標(biāo)記F(forword)，且在基因組 的位置及長度;下游引物應(yīng)標(biāo)記R(reverse)昂羡，且在基因組 的位置及長度絮记。用oligo或primer preiemer軟件 即可計算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超過2℃虐先，長度相差最好不超過4bp怨愤。
3.引物的評價：
用DNAstar 軟件中的Primerselect軟件，點擊“l(fā)og”菜單中的“create primer catalog”蛹批，在“name”中輸入引物的名稱撰洗、位置，按Tab鍵進入“sequence”腐芍，粘貼或輸入要分析的引物序列差导。選中整個序列后，在 “report”菜單下“primer self dimer”,分析引物的二聚體猪勇。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個dimer设褐，并對此引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好)泣刹。在“report”菜單下“primer hairpins”,分析引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)助析。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個hairpins，并對此引物的hairpins進行評價椅您。再選擇所需要的上下游引物貌笨，在“report”菜單下 “primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer襟沮，并對此對引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值锥惋，理論上是dG值越大越好(dG值通常為負(fù)值)，絕對值超過4.5kcal/mol易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶开伏，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進行)膀跌。不必考慮引物與探針 之間的配對與發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因為探針 的Tm值非常之高固灵。
4. 上下游引物與探針的距離(上下游引物的位置)：
理論上講捅伤，上游引物的3’端離探針的5’端為1-20bp，最佳是1bp巫玻，最近為上游引物的3’端離探針的3’端為4bp;下游引物要與探針有一定的距離丛忆，但要保證下游引物的3’端離探針的3’端最為15-150bp祠汇。整個目的片段的長度最好在50-150bp之間，最長不超過 200bp熄诡。
5. 隨機引物：
適用于長的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA可很。適用于rRNA、mRNA凰浮、tRNA 等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)我抠。主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。當(dāng)特定mRNA 由于含有使反轉(zhuǎn)錄 酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時袜茧，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA菜拓。用此種方法時，體系中所有RNA 分子 全部充當(dāng)了cDNA 第一鏈模板笛厦，PCR 引物在擴增過程中賦予所需要的特異性纳鼎。通常用此引物合成 的cDNA 中96%來源于rRNA。
6. Oligo dT：
適用于具有PolyA尾巴的RNA裳凸。(原核生物的RNA贱鄙、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。)由于Oligo dT要結(jié)合到PolyA 尾巴上登舞，所以對RNA樣品的質(zhì)量要求較高贰逾，即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。是一種對mRNA 特異的方法菠秒。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾疙剑，此引物與其配對，僅mRNA 可被轉(zhuǎn)錄践叠。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA 的1-4%言缤，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。
7. 基因特異性引物：
與模板序列互補的引物禁灼，適用于目的序列已知的情況管挟。用含目標(biāo)RNA 的互補序列的寡核苷酸 作為引物，若PCR 反應(yīng)用二種特異性引物弄捕，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始僻孝。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴增守谓。缺點是只能用于單一基因的PCR實驗穿铆。PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小斋荞，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶荞雏。
上述內(nèi)容羅列了RT-PCR設(shè)計的基本原則，都是些理論的知識，大家在用軟件設(shè)計引物的時候可根據(jù)這些理論知識和軟件設(shè)計評估結(jié)果選擇最佳的上下游引物序列凤优。
篇二悦陋、Primer Premier 6 批量引物設(shè)計
2.1?Primer Premier 6 下載 安裝 激活
2.2 準(zhǔn)備待設(shè)計引物的fasta格式序列文件
2.3?打開Primer6軟件，導(dǎo)入序列文件
選項卡選擇 依次打開 File - Open - sequence - From file - 選擇2.2 里面準(zhǔn)備好的序列文件
2.4 依次設(shè)計引物
2.4.1 拖拽選中前10個模板進行引物設(shè)計（軟件最多可同時設(shè)計10個引物）
2.4.2 選項卡依次選擇 Analyze - Primer Search?
2.4.3 在彈出窗口的Search Parameters 里面設(shè)置引物搜索區(qū)域等參數(shù)
2.4.4 在彈出窗口的Search Parameters 里面設(shè)置Tm值筑辨、GC值俺驶、引物長度、產(chǎn)物長度挖垛、引物設(shè)計對數(shù) 等參數(shù)
2.4.5 點擊Search 檢索痒钝，并調(diào)整設(shè)計產(chǎn)物
觀察左側(cè)欄目中的結(jié)果秉颗，對不滿意的依次點擊①"ALL Primers" 按鈕, ②在彈窗中選擇合適的引物痢毒，③點擊 “Replace” 按鈕 替換
2.4.6 調(diào)整完畢后，重復(fù) 2.4.2 - 2.4.5 完成后續(xù)的引物設(shè)計
2.5 保存設(shè)計好的引物
2.5.1 全選sequence information 內(nèi)的內(nèi)容蚕甥，在選項卡中 依次選擇 File - Exprot primer results?
2.5.2 在彈窗中 選擇保存位置
2.6. 檢查導(dǎo)出文件哪替，完結(jié)撒花
