這篇文章于2023年5月發(fā)表于Cell Metabolism（IF=29物邑，Extracellular vesicles in fatty liver promote a metastatic tumor microenvironment），探討了胞外囊泡對腫瘤微環(huán)境形成的作用及其機制叶雹，正在進行相關研究或者苦于細胞間相互作用機制探索的同學可以借鑒一下：

研究意義：結直腸癌（CRC）發(fā)病率位居所有癌癥的第三位着憨，死亡率位居第二墩衙。肝臟是CRC轉(zhuǎn)移最常見的器官，其獨特的代謝和免疫微環(huán)境有利于CRC的肝臟轉(zhuǎn)移甲抖。70%的CRC患者會發(fā)生肝轉(zhuǎn)移漆改，這是CRC致死的主要原因。肥胖和非酒精性脂肪肝（NAFLD）是CRC的重要危險因素准谚，脂肪肝會促進CRC肝臟轉(zhuǎn)移以及CRC肝轉(zhuǎn)移癌組織切除術后復發(fā)挫剑。CRC肝轉(zhuǎn)移小鼠內(nèi)，脂肪肝通過改變肝臟炎癥和免疫微環(huán)境促進轉(zhuǎn)移癌細胞生長柱衔。因此樊破，發(fā)生癌轉(zhuǎn)移脂肪肝其腫瘤微環(huán)境（TME）的異質(zhì)性可能會導致不同CRC遷移機制愉棱，這可能解釋不同CRC患者對治療方式應答的差別。這也提示：對患有脂肪肝的CRC患者哲戚，其肝轉(zhuǎn)移的治療需要采取不同策略奔滑。所以，闡明患有脂肪肝CRC患者其肝轉(zhuǎn)移的分子機制有重要的臨床意義顺少。

? ? ? 胞外囊泡（EVs）含有microRNAs朋其、脂類和蛋白質(zhì)等具有生物活性的物質(zhì)，神經(jīng)酰胺合成通路是調(diào)控其生成和分泌的主要通路（主要由中性鞘磷脂酶和Rab27a/RAB27b等蛋白調(diào)控）脆炎。Rab27a可以介導黑色素瘤EVs的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移梅猿，對脂過載引起的EVs分泌至關重要。NAFLD患者肝細胞來源的EVs分泌增加秒裕，其含有的microRNAs發(fā)生顯著改變袱蚓。此外，有研究指出几蜻，腫瘤來源的EVs可遷移至肝臟并促進利于腫瘤細胞遷移和促遷移炎癥應答環(huán)境的形成喇潘，但CRC肝轉(zhuǎn)移是否與EVs有關未知。

? ? ? YAP是轉(zhuǎn)錄輔因子入蛆，在未被MST1/2-LATS1/2通路磷酸化時响蓉，YAP入核和促癌轉(zhuǎn)錄因子結合，促進癌細胞增殖哨毁、侵襲和遷移相關基因表達。此外源武，G蛋白偶聯(lián)受體和microRNAs也調(diào)控YAP的活性扼褪。YAP還通過上調(diào)PD-L1表達或募集M2型腫瘤相關巨噬細胞（M2-TAMs）及髓系來源抑制細胞構建免疫抑制微環(huán)境，最終促進腫瘤進展粱栖。但YAP在EVs介導的CRC肝轉(zhuǎn)移的作用及其調(diào)控機制還未有相關報道话浇。

研究策略：研究人員通過CRC和其肝轉(zhuǎn)移的密切關系確定的研究目的，然后引入EVs介導的細胞-細胞間的相互作用來探討肝臟微環(huán)境對CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的影響作用和機制闹究。接下來作者特異性的檢測了EVs的重要內(nèi)容物microRNAs在不同條件下的變化譜并鎖定了發(fā)揮作用的關鍵microRNAs幔崖，并依次進行下游靶點的篩選和功能驗證，最終在患有脂肪肝的CRC患者的肝轉(zhuǎn)移組織中驗證出：肝細胞分泌EVs→EVs內(nèi)容物microRNAs抑制Lats2表達→YAP活性增加并入核→直接促進CRC腫瘤細胞生長/通過CYR61構建腫瘤抑制微環(huán)境→促腫瘤進展這一促腫瘤進展的信號軸渣淤。

研究方法：

1赏寇、Increased extracellular vesicle release by fatty liver enhances metastatic tumor growth in the liver（確認CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤細胞生長和EVs及脂肪肝的關系）

? ? ? 首先需要確認脂肪肝對CRC的肝轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移后生長有影響。作者給予小鼠高/低脂飲食（HFD/LFD）構建脂肪肝小鼠模型价认，再于脾臟處注射MC38（CRC細胞系）構建CRC肝轉(zhuǎn)移模型嗅定。高脂飲食小鼠肝臟腫瘤顯著增大，且小鼠和患者血清EVs數(shù)量顯著增加（圖1A-B）用踩。此外渠退，給予HFD小鼠來源以及患者來源的EVs能顯著促進CRC癌細胞增殖忙迁、遷移和侵襲（圖1C-E）。用棕櫚酸酯（PA碎乃，NAFLD患者最豐富的脂類）處理小鼠原代肝細胞（PHCs）和Huh7肝癌細胞系姊扔，收集上清里的EVs處理細胞。PA促進PHCs和Huh7細胞EVs的分泌梅誓，而上述來源EVs促進癌細胞增殖恰梢、遷移和侵襲（圖1F-G）。綜上证九，NAFLD患者肝細胞分泌的EVs促進CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤生長删豺。

圖1

? ? ? Rab27a/b和中性鞘磷脂酶是調(diào)控EVs合成分泌的主要蛋白。HFD飲食小鼠肝臟和NAFLD患者肝臟Rab27a表達顯著增加（圖2A-B）愧怜。敲低Rab27a抑制HFD小鼠CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤生長呀页，但對LFD小鼠沒有影響（圖2C-D）。相反拥坛，過表達Rab27a促進CRC肝轉(zhuǎn)移和生長蓬蝶。綜上，肝細胞Rab27a高表達促進患脂肪肝的CRC患者的肝轉(zhuǎn)移和生長猜惋，這與Rab27a介導的EVs生成有關丸氛。

圖2

2、miRNAs are the functional extracellular vesicle contents that aggravate colorectal cancer growth in fatty liver（確認患脂肪肝的CRC患者肝細胞分泌EVs促進肝轉(zhuǎn)移CRC進展的內(nèi)容物）

? ? ? 接下來作者探討了EVs內(nèi)容物對肝轉(zhuǎn)移CRC細胞的作用著摔。對健康/NAFLD患者缓窜、LFD/HFD飲食小鼠、LFD/HFD飲食CRC模型小鼠來源血的EVs以及HFD飲食小鼠肝細胞和PA處理小鼠肝細胞培養(yǎng)上清EVs的microRNAs進行了分析谍咆。miR-103禾锤、miR-25和miR-92a顯著上調(diào)（圖3A）。接下來便是對microRNAs影響CRC細胞的功能驗證摹察。PA處理肝細胞EVs里miR-103矾利、miR-25和miR-92a表達增加捣鲸，癌細胞內(nèi)過表達microRNAs促進細胞增殖亿驾、遷移和侵襲糯而，抑制micrRNAs則緩解癌細胞增殖、遷移和侵襲（圖3B-F）克滴。綜上逼争，miR-103、miR-25和miR-92a是患有脂肪肝的CRC患者肝細胞分泌的EVs促進肝轉(zhuǎn)移結直腸癌生長的重要調(diào)控因子偿曙。

圖3

3氮凝、EVs containing miRNAs regulate pro-tumorigenic YAP signaling in colorectal cancer cells（尋找內(nèi)容物下游）

? ? ? 接下來作者嘗試找到上述microRNAs調(diào)控的直接靶點。通過同時使用多種生物信息學預測工具望忆，作者發(fā)現(xiàn)Lats2（YAP經(jīng)典上游）表達顯著下調(diào)（圖4A-B）罩阵。過表達microRNAs促進YAP入核（圖4C）竿秆。熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鳎琺icroRNAs通過與Lats2的3’UTR區(qū)結合抑制其轉(zhuǎn)錄（圖4D）稿壁。PA處理肝細胞來源的EVs降低Lats2表達并促進YAP核定位幽钢，抑制microRNAs則逆轉(zhuǎn)上述改變（圖4E-F）。綜上傅是，miR-103匪燕、miR-25和miR-92a通過直接抑制Lats2表達激活YAP，促進CRC進展喧笔。

圖4

4帽驯、YAP activity is increased in colorectal cancer liver metastasis enhanced by non-alcoholic fatty liver disease

? ? ? RNA-seq結果表明，HFD飲食小鼠腫瘤細胞YAP和癌癥進展相關基因顯著富集（圖5A）书闸。HFD飲食CRC小鼠其轉(zhuǎn)移腫瘤細胞YAP核定位尼变、YAP表達和下游靶基因表達顯著增加，但上游抑制分子Lats2表達顯著下調(diào)（圖5B-D）浆劲。敲低HFD飲食CRC小鼠肝細胞Rab27a恢復肝轉(zhuǎn)移腫瘤Lats2表達嫌术、YAP的核定位以及靶基因表達（圖5E）。因此牌借，患有脂肪肝的CRC患者肝細胞分泌的EVs通過上調(diào)YAP活性促進肝轉(zhuǎn)移腫瘤進展度气。

圖5

5、YAP signaling promotes metastatic tumor growth and an immunosuppressive environment in fatty liver

? ? ? 接下來作者進一步探討了YAP在脂肪肝肝細胞EVs促肝轉(zhuǎn)移CRC進展的作用機制膨报。敲低腫瘤細胞Yap1抑制PA處理肝細胞分泌EVs對CRC細胞增殖磷籍、遷移和侵襲的促進作用（圖6A）。體內(nèi)實驗結果表明现柠，敲低癌細胞Yap1顯著抑制腫瘤生長和相關促腫瘤進展信號通路（圖6B-C）择示。脂肪肝可通過促進M2-TAM浸潤形成免疫抑制微環(huán)境，而敲低腫瘤細胞Yap1則抑制脂肪肝引起的M2-TAM浸潤（圖6D）晒旅。肝臟巨噬細胞和腫瘤細胞共培養(yǎng)顯著促進巨噬細胞遷移，而敲低腫瘤細胞Yap1則抑制肝臟腫瘤細胞遷移（圖6E）汪诉。此外废恋，上述共培養(yǎng)促進巨噬細胞向M2極化，而敲低Yap1抑制極化作用（圖6F）扒寄。因此鱼鼓，YAP既促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲该编，又間接調(diào)控癌細胞TME迄本。

圖6

? ? ? 接下來作者想找到YAP調(diào)控腫瘤細胞TME的下游分子。在眾多YAP下游分子里课竣，Ccn1編碼的CYR61是分泌型的趨化因子嘉赎，其在CRC的表達隨YAP敲低而降低（圖7A）置媳。體內(nèi)和體外實驗結果表明，敲低腫瘤細胞的Ccn1能抑制共培養(yǎng)巨噬細胞的遷移和M2極化（圖7B-C）公条。因此拇囊，YAP通過調(diào)節(jié)CYR61的表達和分泌介導TME。此外靶橱，作者還利用單細胞RNA-seq對腫瘤細胞周圍的免疫細胞進行了分析寥袭。他們在高脂飲食小鼠腫瘤組織找到了2個M1 TAM亞群 、4個M2 TAM亞群和2個CD8+T細胞亞群关霸，且M2亞群均屬于NAFLD疾病里支持腫瘤生長的巨噬細胞亞型（圖7D-E）传黄。

圖7

6、Increased YAP activity and an immunosuppressive tumor microenvironment in patients with colorectal cancer liver metastasis and non-alcoholic fatty liver disease

? ? ? 最后队寇，作者用患有脂肪肝的CRC病人樣本對上述結果進行了確認膘掰。患有脂肪肝的CRC病人其腫瘤組織YAP核定位英上、CYR61表達和腫瘤組織M2-TAM的浸潤顯著增加（圖8A-B）炭序。質(zhì)譜流式技術（Imaging mass cytometry，IMC）結果顯示苍日，患有脂肪肝的CRC患者M2-TAM和CD8+T細胞顯著增加（圖8C-D）惭聂。患有脂肪肝的CRC病人原發(fā)病灶腫瘤組織YAP和Ki67表達較沒有脂肪肝的CRC病人原發(fā)病灶高相恃，而轉(zhuǎn)移腫瘤組織YAP和Ki67表達比原發(fā)病灶高（圖8E）辜纲。對細胞間距離進行分析發(fā)現(xiàn)，M2-TAM更接近YAP陽性的腫瘤細胞拦耐，而CD8+T細胞則相反（圖8F）耕腾。患者樣本檢測結果表明杀糯，脂肪肝影響CRC肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤組織的YAP表達扫俺、腫瘤細胞生長以及其周圍免疫細胞的功能和分布。

圖8

Take-home message：

? ? ? 這個故事結合臨床“CRC患者普遍會發(fā)生肝轉(zhuǎn)移”固翰，以及脂肪肝會促進CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤進展和復發(fā)的臨床現(xiàn)象狼纬，提出“脂肪肝影響CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤進展機制”。這里他們利用EVs這一可以在細胞間遞送具有生物活性分子繼而介導彼此間作用的特殊結構進行預實驗骂际。他們發(fā)現(xiàn)EVs的確介導了脂肪肝肝細胞對CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤的促進作用疗琉。此外，在探討可能作用機制的時候歉铝，直接錨定在了microRNAs盈简，后續(xù)也的確找到了有效應的三條microRNAs。然后他們以microRNAs為突破口，接下來就是一系列下游靶點預測和相應功能的驗證柠贤∠愫疲總體而言，這個故事臨床意義較大种吸，為CRC的肝臟轉(zhuǎn)移和復發(fā)提供了新的治療方向和靶點弃衍，機制層面EVs到YAP調(diào)控腫瘤細胞的免疫微環(huán)境的驗證也較完整。但具體患有脂肪肝的CRC患者其EVs分泌為什么增加（Rab27a表達調(diào)控上游）坚俗，以及腫瘤細胞CYR61介導免疫抑制微環(huán)境形成的具體分子機制是沒有闡明的問題镜盯。YAP促進腫瘤細胞增殖、遷移和分化已有很多相關報道猖败，可能這是作者后面提出YAP可以調(diào)控局部微環(huán)境的原因（增加新穎性）速缆。此外，YAP的上游LATS2表達固然重要恩闻，但考慮到其活性受磷酸化調(diào)控艺糜，僅僅檢測其表達說服力不足。

? ? ? 做一個好課題幢尚，運氣是非常重要的破停。就這篇文章而言，沒有前期的研究做鋪墊尉剩，突然提出“EVs影響肝轉(zhuǎn)移腫瘤進展”以及“EVs內(nèi)的microRNAs是影響EVs作用的主要分子”這種假說真慢，恰好表明科研有時候是沒有邏輯的±砭ィ科研有時候就和投資一樣：風險越大黑界，收益越大。如果做科研的路上沒有思路和想法皂林，不妨跳出固有的思維邏輯朗鸠，冒險嘗試一些不同的想法，可能會別有一番天地础倍。