陰性對照設(shè)置

參考：【研究生】流式細(xì)胞術(shù)原理儒鹿、熒光通道、流式圖几晤、實(shí)驗(yàn)對照設(shè)計(jì)等_嗶哩嗶哩_bilibili

屏幕截圖 2022-10-07 165705.png

同型對照選擇

一般抗體購買時會給推薦相應(yīng)得同型對照
參考：流式檢測中同型對照與二抗及封閉劑的區(qū)別约炎？ - 知乎 (zhihu.com)
同型與一抗區(qū)別是：同型對照抗體是沒有特異靶標(biāo)的一抗，也就是說抗體的可變區(qū)或者說fab段(與抗原特異性結(jié)果的部位）是不一樣的。其他區(qū)域是一樣的圾浅。
同型對照作用：排除非特異性結(jié)合：
（1）抗體與靶細(xì)胞上的 Fc 受體結(jié)合掠手，（2）抗體與細(xì)胞蛋白、碳水化合物和脂類的非特異性結(jié)合和狸捕。

image.png

封閉劑又叫FC受體阻斷劑：意思就是喷鸽，細(xì)胞表面的FC受體都是我的，你一抗別想搶灸拍，搶也搶不到做祝。細(xì)胞上的FC受體能結(jié)合抗體的FC段，造成非特異結(jié)合鸡岗。有N多種細(xì)胞的FC受體能結(jié)合FC段混槐，但是，有三種細(xì)胞結(jié)合力相對較強(qiáng)纤房，見下圖纵隔，也就是表達(dá)DC64,CD32,CD16的這幾種細(xì)胞（真好記，16炮姨，162=32捌刮，322=64，是巧合還是有什么我不知道的隱秘）舒岸。<img src="https://pica.zhimg.com/50/v2-c27298ce84d93aee79ec395939e6cbea_720w.jpg?source=1940ef5c" data-caption="" data-size="normal" data-rawwidth="749" data-rawheight="371" data-default-watermark-src="https://picx.zhimg.com/50/v2-11f11c58ac9a2ff62f5ac080e5f0af55_720w.jpg?source=1940ef5c" class="origin_image zh-lightbox-thumb" width="749" data-original="https://picx.zhimg.com/v2-c27298ce84d93aee79ec395939e6cbea_r.jpg?source=1940ef5c"/>
從上面來看绅作，兩者差不多，又有區(qū)別蛾派。同型抗體能與FC受體結(jié)合俄认，但是結(jié)合能力和一抗是一樣的，也就是說洪乍，也就那三種細(xì)胞結(jié)合的比較多眯杏，背景噪音比較高。其他的細(xì)胞壳澳，結(jié)合很少岂贩。而FC受體阻斷劑不同，管你什么細(xì)胞的fc受體巷波，管你有沒有能力結(jié)合FC段萎津，通通封殺，不要影響抗體兄弟抹镊★鼻抗體與細(xì)胞蛋白、碳水化合物和脂類的非特異性結(jié)合和垮耳，這點(diǎn)的話颈渊，同型可以解決，封閉應(yīng)該解決不了。但這種結(jié)合能結(jié)合多少儡炼？影響多大妓湘？我不知道，應(yīng)該沒什么影響乌询“裉總結(jié)：封閉劑效果更好，表現(xiàn)出真實(shí)的熒光強(qiáng)度妹田，同型抗體可能造成背景高唬党，對結(jié)果可能造成影響。況且鬼佣，并不是每個抗體都能找到同型抗體（理論上能）驶拱。而且，封閉劑便宜晶衷。所以說蓝纲，能用封閉就封閉吧！

熒光補(bǔ)償問題

參考：想了解“熒光補(bǔ)償”的相關(guān)知識嗎晌纫？看這里税迷！ - 知乎 (zhihu.com)
【流式集訓(xùn)營】FlowJo調(diào)補(bǔ)償?shù)囊欢絖嗶哩嗶哩_bilibili

哪些染料之間有熒光補(bǔ)償：

1、由同一個激發(fā)光激發(fā)的熒光染料之間才會涉及補(bǔ)償锹漱，例如：FITC/PE/Percp/PE-Cy5/PE-Cy7箭养。不同激發(fā)光激發(fā)的兩種熒光染料之間幾乎沒有補(bǔ)償；例如PE和APC哥牍；

2毕泌、由同一個激發(fā)光激發(fā)的熒光染料，如果發(fā)射光譜之間有重疊部分則一定有補(bǔ)償嗅辣，一般而言發(fā)射光譜相鄰的兩種染料之間會有補(bǔ)償撼泛；

3、注意耦聯(lián)染料的補(bǔ)償澡谭，像PE-Cy5和APC是由不同的激發(fā)光激發(fā)坎弯，但兩者之間補(bǔ)償太大，不能同時使用译暂，請看如下解釋：

image.png

image.png

image.png

image.png

如何調(diào)整熒光補(bǔ)償呢？撩炊？外永？

參考：科學(xué)網(wǎng)—如何確定流式分析中熒光補(bǔ)償是正確的呢？ - 張千君的博文 (sciencenet.cn)
在實(shí)驗(yàn)時直接調(diào)補(bǔ)償拧咳，可以根據(jù)自己選擇的染料事先看一下BD 熒光viewer伯顶，看看發(fā)射光譜有沒有重疊，簡單判斷是否有補(bǔ)償。在做預(yù)實(shí)驗(yàn)時祭衩，每一個通道都要做一個單染管灶体，用來調(diào)補(bǔ)償。補(bǔ)償調(diào)好后正式實(shí)驗(yàn)直接用就可以了掐暮，不要再改變?nèi)玖系捏w積用量蝎抽，不要改變電壓，一般來說路克，波動不會太大的樟结。

1. 建立普通specimen:specimen_001

新建一個experiment,在這個experiment下面建立一個specimen_001，在parameter中選擇合適的通道.

2. 建立補(bǔ)償specimen：compensation controls

step1:如 圖1： 在頂部experiment中選擇compensation setup,然后create compensation controls.

image.png

step2:如 圖2：勾上include seperate unstainded controls tube/well,點(diǎn)擊ok.

image.png

image.png

step4: 利用NC管調(diào)整所有marker的陰性群在10^2左邊，不record數(shù)據(jù)
step5：利用單陽管調(diào)整每一個單陽管marker的陽性群在視野內(nèi)灰羽，不record數(shù)據(jù)
step6：step4&5調(diào)整好每個marker的電壓后驮履，將單陽管調(diào)整好的電壓分別輸入NC管中。并重新loadNC管和每一個單陽管廉嚼，分別record數(shù)據(jù)玫镐。
step7:計(jì)算補(bǔ)償：點(diǎn)擊頂部experiment_compensation setup_calculate compensation。

image.png

image.png

image.png

image.png

image.png

3. 以上摘悴，補(bǔ)償就調(diào)節(jié)好了，切換到specimen_001實(shí)驗(yàn)舰绘，直接只load一個mix管就可以自動使用調(diào)整好的補(bǔ)償電壓了蹂喻。