前言
? ? ? 單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）是目前最前沿蝶锋，能進(jìn)行大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)彤钟，為理解細(xì)胞組成和動(dòng)態(tài)生物學(xué)過程提供了很多新的見解胳搞。單細(xì)胞研究已經(jīng)為我們理解發(fā)育過程会前，老化和疾膊η（如癌癥）等提供了大量數(shù)據(jù)蛔溃。在這里，小編主要就前期的樣本準(zhǔn)備與保存需注意問題給大家進(jìn)行講解篱蝇，以備大家在不同的研究場景和研究背景下贺待，走好單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的第一步。
1.細(xì)胞樣本
細(xì)胞準(zhǔn)備量：
細(xì)胞總量＞5×10^5?cells
采集及運(yùn)輸：
外周血（PBMC）單核細(xì)胞
· 通常采用Ficoll密度梯度離心法分離血液中的PBMC細(xì)胞零截。
·?如不能立即進(jìn)行單細(xì)胞測序?qū)嶒?yàn)狠持，在提取到狀態(tài)良好的PBMC后，可選擇凍存后寄送瞻润。
培養(yǎng)細(xì)胞
·懸浮細(xì)胞可直接將細(xì)胞懸液輕柔吹打混勻喘垂；貼壁細(xì)胞一般用0.25%的Trypsin-EDTA酶消化解離甜刻；脆弱細(xì)胞系使用強(qiáng)度稍弱的膠原酶進(jìn)行處理，有效保證細(xì)胞活率正勒。用含?0.05% BSA的PBS（或常規(guī)培養(yǎng)基）或含5%的FBS重懸清洗細(xì)胞得院。
· 2-8℃放置，2h內(nèi)進(jìn)行單細(xì)胞微反應(yīng)體系的構(gòu)建章贞。對(duì)于需運(yùn)輸或者保存的細(xì)胞祥绞，可凍存處理。
細(xì)胞凍存：
·?將10^6~10^7個(gè)細(xì)胞鸭限，重懸于1mL細(xì)胞凍存液中蜕径，轉(zhuǎn)移入外螺旋式凍存管，程序降溫至-80℃败京，轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存兜喻。凍存細(xì)胞干冰運(yùn)輸?shù)焦緦?shí)驗(yàn)室，在3個(gè)月內(nèi)復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)赡麦。
·?凍存細(xì)胞的規(guī)范性對(duì)細(xì)胞凍存質(zhì)量影響較大朴皆，需嚴(yán)格遵守梯度凍存程序。
2.組織樣本
樣本采集
1. 新鮮組織：樣本量≥200mg（至少黃豆大蟹捍狻）遂铡；
2. 穿刺組織：≥2條（長度1.5cm，直徑≥1.5mm）晶姊；
保存及運(yùn)輸
? ? ? 新鮮組織樣本要求全部浸沒于預(yù)冷的美天旎組織保存液（Miltenyi扒接，貨號(hào)：130-100-008）2ml離心管中，并保持4℃環(huán)境们衙。
? ? ? 用氣泡袋包裹放有組織的離心管钾怔，并在氣泡袋周圍放上冰袋，切記不可冰袋直接接觸樣本砍艾，離體 48h 內(nèi)運(yùn)輸至公司實(shí)驗(yàn)室開展單細(xì)胞測序?qū)嶒?yàn)。
注意事項(xiàng)：
1. 取樣一致：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組樣本的采集狀態(tài)盡量保持一致
? ? ? 選取臨床組織的獲取對(duì)象巍举，需綜合考慮飲食脆荷、煙酒習(xí)慣、藥物懊悯、生物鐘時(shí)間規(guī)律等多種影響因素蜓谋；選取動(dòng)物組織的獲取對(duì)象，需綜合考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系炭分、周齡/月齡桃焕、性別、飼養(yǎng)條件捧毛、健康狀況观堂、實(shí)驗(yàn)表型等多種影響因素让网；建議實(shí)驗(yàn)組樣本與對(duì)照組樣本的采集狀態(tài)盡量保持一致，以盡可能降低其它未知因素對(duì)單細(xì)胞測序?qū)嶒?yàn)結(jié)果的影響师痕。?
2.?取樣準(zhǔn)確：盡量剔除非目標(biāo)組織溃睹，如多余脂肪、包膜胰坟；清洗去除血液殘留
? ? ? 血液清洗：使用 1×DPBS 或生理鹽水對(duì)取樣后的組織樣本即時(shí)反復(fù)清洗因篇，盡可能去除血細(xì)胞。
? ? ? 凝固的血液影響解離效果笔横，血液中有有核細(xì)胞竞滓，裂紅液無法去除血液樣本中的有核細(xì)胞。
3.保持濕潤：取樣后盡快轉(zhuǎn)入組織保存液中
? ? ? 樣本在空氣中長時(shí)間暴露吹缔，容易出現(xiàn)組織表面細(xì)胞的脫水死亡商佑。對(duì)于直徑偏小的組織，長時(shí)間暴露可能直接導(dǎo)致樣本無法獲取足夠的單細(xì)胞懸液涛菠。例如：穿刺樣本莉御、活檢鉗取樣的小直徑顆粒組織。
4.避免污損：避免化學(xué)試劑污染及熱損傷
? ? ? 如不可避免需使用激光刀俗冻、電刀等樣本采集工具礁叔，應(yīng)剔除熱損傷部分；活檢取樣每次夾取的樣本最好取大塊迄薄，以減少細(xì)胞損傷琅关，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成不可逆的影響。
3.液體樣本處理
樣本類型? ? ? ? ?取樣量? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?保存及運(yùn)輸
PBMC? ? ? ? ? ? ? ≥4ml? ? ? ? ? ? EDTA抗凝采血管收集讥蔽，采樣后及時(shí)顛倒混勻涣易，取樣后4℃運(yùn)輸，8h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室
淋巴液? ? ? ? ? ? ? ≥4ml? ? ? ? ? ?取樣后加入5-10%體積比的FBS進(jìn)行保護(hù)冶伞，取樣后4℃運(yùn)輸新症，4h運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室
腦脊液? ? ? ? ? ? ? ≥4ml? ? ? ? ? ?腦脊液中細(xì)胞對(duì)環(huán)境溫度變化較為敏感，處理中不宜溫差過大响禽，離體時(shí)間不宜過長徒爹，取樣后4℃運(yùn)輸，2h運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室
4.類器官樣本
類器官簡介：
? ? ? 類器官（Organoids）指利用成體干細(xì)胞或多能干細(xì)胞進(jìn)行體外三維培養(yǎng)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織類似物（通常包含多種細(xì)胞類型）芋类。盡管類器官并不是真正意義上的人體器官隆嗅，但能在結(jié)構(gòu)和功能上模擬真實(shí)器官，能夠最大程度地模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)及功能侯繁，并能夠長期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)胖喳。與動(dòng)物模型相比，類器官模型的操作更簡單贮竟，還能用于研究疾病發(fā)生和發(fā)展等機(jī)理丽焊。
? ? ? 類器官通常培養(yǎng)于細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的基質(zhì)膠中较剃，包含一些層粘連蛋白、膠原蛋白粹懒、生長因子等重付，可以在4°C 溶化為液體，并且可以在37°C重新凝固凫乖，為細(xì)胞在空間中生長提供重要的微環(huán)境與組織支撐确垫。
常溫運(yùn)輸：
? ? ? 類器官，由于類型不一帽芽，所以取樣和運(yùn)輸環(huán)境要求不同删掀。常規(guī)的組織、器官或者細(xì)胞需要低溫運(yùn)輸导街；但是披泪，如神經(jīng)類的類器官低溫運(yùn)輸，或者離開生長環(huán)境之后組織質(zhì)量會(huì)有明顯下降搬瑰；所以類器官建議常溫運(yùn)輸款票，對(duì)于夏季較為炎熱的地區(qū)，運(yùn)輸需要少量冰袋維持環(huán)境溫度不能過高泽论，冰袋不能直接接觸樣本艾少，要遠(yuǎn)距離（20cm左右）隔離；對(duì)于冬季溫度較低的運(yùn)輸環(huán)境翼悴，需要保證室溫~37℃的運(yùn)輸環(huán)境缚够。
5.冰凍抽核樣本
? ? ? 對(duì)于冰凍組織樣本，直接抽提細(xì)胞核進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序分析鹦赎。
? ? ? 單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序（Single Nuclei RNA Sequencing谍椅，snRNA-seq）區(qū)別于常規(guī)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，不需要酶解消化古话，一定程度上打破了新鮮組織樣本解離和運(yùn)輸?shù)木窒扌猿裕軌蚋鎸?shí)反應(yīng)細(xì)胞組成情況，在特殊樣本處理和珍貴樣本轉(zhuǎn)錄組信息獲得上存在獨(dú)特優(yōu)勢陪踩。
取樣及保存：
? ? ? 抽核組織取樣后如果有大量血液需要用DPBS或者生理鹽水清洗后杖们，吸水紙盡量去除水分，液氮速凍后-80℃或者液氮存儲(chǔ)膊毁。-80℃長期存儲(chǔ)的樣本需要在離心管外胀莹，套上1-2層封口袋基跑，盡量減少組織失水的情況發(fā)生（此步類似空轉(zhuǎn)組織保存）婚温。存儲(chǔ)超過1個(gè)月以上的組織抽核前最好做一次RNA提取質(zhì)檢，保證RNA的完整性后再進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)媳否。
干冰運(yùn)輸：
? ? ? 凍存組織樣本用干冰運(yùn)輸至公司實(shí)驗(yàn)室栅螟。保證干冰充足荆秦，確保樣本到達(dá)時(shí)仍處于凍存的環(huán)境。可根據(jù)運(yùn)輸距離、溫度师妙、快遞實(shí)時(shí)情況等绅项，按照每天消耗1.5kg干冰的量適當(dāng)添加干冰。
6.特殊樣本處理
組織特殊
細(xì)胞脆弱：建議直接抽核獲得單核懸液
? ? ? 對(duì)于細(xì)胞脆弱的組織铡溪，如肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞或成熟脂肪細(xì)胞，容易破裂，且細(xì)胞較大刑桑，通過酶解消化，很難拿到目的細(xì)胞比例較高的單細(xì)胞懸液募舟，建議組織直接抽核獲得單核懸液祠斧。
高脂肪含量：建議抽核
? ? ? 對(duì)于脂肪含量較高的組織，脂質(zhì)密度低拱礁，所以解離離心過程中處于漂浮或者懸浮狀態(tài)琢锋，不易沉底（未成熟脂肪細(xì)胞除外），離心棄上清及收集過篩之后成熟脂肪細(xì)胞容易去除呢灶，只有部分未成熟脂肪細(xì)胞在離心時(shí)能沉底富集吴超，被上機(jī)捕獲，但占比有限填抬。
細(xì)胞異型：建議抽核烛芬，獲取單細(xì)胞核懸液
? ? ? 對(duì)于細(xì)胞異型的組織，如肌肉飒责、心臟赘娄、腦、神經(jīng)等組織宏蛉，由于細(xì)胞直徑過大遣臼，不能通過微流控芯片，容易造成芯片管道堵塞拾并，微滴生成失敗揍堰，建議選用抽核的方式，獲取單細(xì)胞核測序數(shù)據(jù)嗅义。
易降解：避免過度清洗屏歹，且不要長途運(yùn)輸
? ? ? 對(duì)于自身容易降解的樣本，如胰腺（自身分泌酶液）之碗、小鼠腸道（腸道含有消化食物酶）等蝙眶，需注意避免過度清洗，且盡量不要長途運(yùn)輸褪那，盡快消化上機(jī)幽纷。
高度損傷或病變組織：包含周圍組織進(jìn)行保護(hù)
? ? ? 既要考慮課題需要式塌，又要保證組織良好狀態(tài)（如：高度損傷或者病變的目標(biāo)組織，取樣往往需要更多組織量友浸，包含周邊區(qū)域組織進(jìn)行保護(hù)峰尝。
7.非模式動(dòng)物
? ? ? 除常規(guī)物種人、猴收恢，小鼠武学、大鼠等哺乳動(dòng)物外，單細(xì)胞測序也廣泛應(yīng)用在淡水生物伦意、海洋動(dòng)物劳淆、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物默赂、禽類沛鸵、昆蟲、植物等（如：斑馬魚缆八，水母曲掰，蛇，蛙類奈辰，鳥禽類栏妖，果蠅，寄生蟲奖恰，水螅吊趾，擬南芥，作物瑟啃，珍惜保護(hù)植物）諸多物種中论泛，需要根據(jù)物種特性及其生存環(huán)境，在取樣蛹屿、保存及運(yùn)輸條件上進(jìn)行調(diào)整屁奏。
以下經(jīng)驗(yàn)可供參考：
送樣量：0.5 cm3
保存介質(zhì)：模擬物種生存環(huán)境
? ? ? 需要模擬物種生存環(huán)境或相應(yīng)細(xì)胞系培養(yǎng)環(huán)境，制定取樣错负、保存及運(yùn)輸方式坟瓢。特殊樣本由于自身特點(diǎn)，即便用好的保存介質(zhì)也需要特殊處理犹撒，才能高質(zhì)量保存折联。如：變態(tài)發(fā)育動(dòng)物肺組織、脂肪組織识颊，由于存在肺泡結(jié)構(gòu)或高脂肪含量诚镰，在保存液中處于漂浮狀態(tài)。
送樣時(shí)間：避免遠(yuǎn)距離運(yùn)輸
? ? ? 遠(yuǎn)距離運(yùn)輸對(duì)部分類型，或者特殊處理的組織樣本細(xì)胞活率影響較大（如：造模的缺氧神經(jīng)類組織怕享，關(guān)注免疫細(xì)胞的新鮮血樣）。
送樣溫度：恒溫
? ? ? 由于生存環(huán)境差異镰踏，對(duì)同樣溫度敏感有差異函筋，所以保存溫度的要求不能一概而論，需要針對(duì)性進(jìn)行調(diào)整（如：粒細(xì)胞不喜歡低溫刺激奠伪，特別是反復(fù)變溫）跌帐。
細(xì)胞分選樣本制備將在下期講解，請(qǐng)持續(xù)關(guān)注哦绊率！
