生物信息分析的前提是獲得了測(cè)序數(shù)據(jù)酱鸭，關(guān)于測(cè)序原始數(shù)據(jù)也涉及非常多知識(shí)及細(xì)節(jié)，如果明白了測(cè)序原理及測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)生的過程蔚舀，在理解關(guān)于原始數(shù)據(jù)的各個(gè)問題上也比較容易。
回顧測(cè)序歷史礼患，目前已經(jīng)形成了三種測(cè)序方法，從上個(gè)世紀(jì)70年代的Sanger測(cè)序到90年代的二代測(cè)序，再到長度更長的三代測(cè)序领曼，都為快速宋舷、高效獲得基因序列提供了技術(shù)支持音诈。
Sanger測(cè)序
1970s年桑格開發(fā)的能完成最長1000bp序列的雙脫氧終止反應(yīng)细溅，因?yàn)樵摷夹g(shù)用于高達(dá)99.999%的測(cè)序準(zhǔn)確率，而被用于人類基因組計(jì)劃完成基因組的測(cè)序（改良的桑格法）朋贬。但是其因?yàn)橥康停ㄒ淮沃荒軠y(cè)一條序列）、成本高，而不適用于大基因組的測(cè)序赎线。
桑格法的主要思想是济似，構(gòu)建4個(gè)反應(yīng)體系蓖扑，（A, T, G, C四種堿基），分別加入引物柜去、DNA聚合酶、四種dNTP根盒、一定比例的ddNTP（帶有放射性標(biāo)記）。由于ddNTP的加入，導(dǎo)致互補(bǔ)鏈的合成被終止，當(dāng)然ddNTP的結(jié)合是隨機(jī)性的，但是在一定時(shí)間內(nèi)痰驱，ddNTP會(huì)結(jié)合完所有的位點(diǎn)叫潦。雖然會(huì)有ddNTP和dNTP結(jié)合在同一個(gè)位點(diǎn)短蜕，但是在凝膠電泳和放射自顯影試驗(yàn)中卿操，只有ddNTP會(huì)被檢測(cè)到扇雕，并通過堿基互補(bǔ)推算出待測(cè)序列。
【PCR實(shí)驗(yàn)是在1983年出現(xiàn)的移国，那么如果需要建立這四個(gè)反映體系，那不是需要多條模板鏈祝懂，那這么多的模板鏈除了擴(kuò)增還有什么方法？或者說，如何獲得這些模板鏈？】
Illumina 二代測(cè)序
二代測(cè)序有不同的平臺(tái)，包括Roche 454測(cè)序儀，Illumina Solex/Hiseq 和ABI SOLID，其中以Illumina Hiseq市場(chǎng)份額較多（75%）。其開發(fā)的PE 雙端測(cè)序方法的主要特點(diǎn)是，借助橋式PCR擴(kuò)增榨为，實(shí)現(xiàn)了通量上的極大提高日川。
一些必須了解的名詞
- flowcell： 測(cè)序反應(yīng)的載體/容器，1個(gè)flowcell有8個(gè)lane职抡，每個(gè)lane包含兩列（swath），每一列有60個(gè)tile缚甩，每個(gè)tile會(huì)種下不同的cluster萨蚕，每個(gè)tile在一次循環(huán)中會(huì)拍照4次（每個(gè)堿基一次）
- lane： 測(cè)序反應(yīng)的平行泳道，試劑添加蹄胰、洗脫等過程的發(fā)生位置
- tile： 每次熒光掃描的位置岳遥，肉眼是看不到的
- 雙端測(cè)序： 可能序列比較長有四五百bp，兩邊各測(cè)120-150bp
- junction： 雙端測(cè)序中間一些沒有測(cè)到的區(qū)域
構(gòu)建文庫
超聲波將DNA分子打斷成300-800bp長序列片段（人類基因組打成300-500bp）裕寨，用酶補(bǔ)平為平末端浩蓉，然后3‘端加一個(gè)A堿基（因?yàn)榻宇^的3‘端有一個(gè)突出的T），再在兩端加上互補(bǔ)配對(duì)的adapter宾袜，再通過PCR擴(kuò)增達(dá)到一定濃度捻艳，構(gòu)成單鏈DNA文庫。
接頭主要有兩個(gè)作用庆猫，1. 實(shí)現(xiàn)橋式擴(kuò)增认轨，高效；2. 可以實(shí)現(xiàn)雙端測(cè)序
橋式PCR
進(jìn)行橋式PCR的關(guān)鍵在于待測(cè)序列5’和3’接頭設(shè)計(jì)及flowcell 的lane的與接頭互補(bǔ)的接頭月培。橋式PCR的過程可以通過擴(kuò)增正義鏈步驟理解嘁字，主要包括以下幾個(gè)步驟：
- 對(duì)模板鏈（p5-p7）進(jìn)行擴(kuò)增，獲得雙鏈互補(bǔ)鏈（p5'-p7'）
- 洗脫模板鏈（強(qiáng)堿試劑作用下兩條鏈被分開杉畜，由于模版鏈沒有附著在lane上纪蜒，模版鏈被沖走，但是互補(bǔ)鏈依然穩(wěn)穩(wěn)固定在lane上）
- 形成橋式（互補(bǔ)鏈p7' 與lane上 p7互補(bǔ)此叠，并通過擴(kuò)增獲得正義鏈p7-p5纯续，與模板鏈一致）
- 循環(huán)，獲得一群序列完全相同的cluster，目的在于實(shí)現(xiàn)放大單一堿基的信號(hào)強(qiáng)度猬错，滿足后期測(cè)序需求
- 解鏈窗看。橋式PCR完成后，形成了很多的橋形的互補(bǔ)雙鏈倦炒，再次強(qiáng)堿解鏈显沈。利用一種酶--甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）選擇性的切掉lane 上p5‘ 連接的鏈，只留下了與lane p7連接的鏈即Forward Strand
總之析校，因?yàn)榻宇^的設(shè)計(jì)，及互補(bǔ)配對(duì)的特性铜涉，使得最后能只保留正義鏈智玻，進(jìn)行測(cè)序。
幾點(diǎn)注意：
- lane與lane之間一般不會(huì)相互影響芙代，也就是說一般不會(huì)出現(xiàn)lane1固定的DNA又與lane2結(jié)合吊奢。
- lane上隨機(jī)分布兩種接頭，p5’（與P5互補(bǔ)）纹烹，P7（與P7'互補(bǔ)）页滚。
待測(cè)序列自帶了p5接頭和p7接頭；- 序列只能一開始是利用p5接頭互補(bǔ)铺呵，因?yàn)閜7接頭和lane是一樣的嘛
測(cè)序
測(cè)序的原理是裹驰，邊合成邊測(cè)序，通過每次加入一個(gè)熒光堿基片挂，并檢測(cè)熒光信號(hào)幻林，然后立即對(duì)其淬滅，接下來完成下一輪的堿基信號(hào)探測(cè)音念。雙端測(cè)序的順序是沪饺，先對(duì)正義鏈測(cè)序，然后index測(cè)序闷愤，最后反義鏈測(cè)序整葡。
正義鏈每一輪測(cè)序步驟：
- 引物結(jié)合到p5端
- 聚合酶作用完成一個(gè)堿基合成（一種特殊的dNTP【它的3‘ 羥基被疊氮基團(tuán)替代，因此每次只能添加一個(gè)dNTP讥脐；還含有熒光基團(tuán)遭居，能激發(fā)不同顏色】）
- 加入激發(fā)熒光緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)（在dNTP被添加到合成鏈上后旬渠，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫掉）
這一個(gè)循環(huán)就能測(cè)定flowcell上成千上萬的cluster魏滚，這就實(shí)現(xiàn)了高通量
- 下一輪測(cè)序。加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并使dNTP 3’ 疊氮基團(tuán)變成羥基坟漱，這樣能繼續(xù)向下進(jìn)行再加一個(gè)鼠次，并且保證這個(gè)不再發(fā)出熒光
在所有正義鏈完成測(cè)序后，合成稱為被洗脫，然后開始index測(cè)序檢測(cè)腥寇。首先對(duì)通過index1的引物結(jié)合位點(diǎn)完成index1完成測(cè)序成翩，并洗脫合成產(chǎn)物，然后再通過正義鏈的p5與lane上的p5'互補(bǔ)赦役，完成index2的測(cè)序麻敌，并洗脫產(chǎn)物。
洗脫掉index2 產(chǎn)物后掂摔，還是一個(gè)橋式擴(kuò)增术羔，得到雙鏈，再變性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand乙漓， 除去測(cè)完的Forward strand级历。然后和測(cè)Forward一樣，也是先連接primer叭披，只是連接的位點(diǎn)是Primer Binding Site2寥殖，測(cè)完后得到reverse strand序列。
數(shù)據(jù)產(chǎn)生
從熒光信號(hào)的產(chǎn)生到堿基序列的識(shí)別這一過程涩蜘，主要包括圖象校正（即空間校正）嚼贡、cluster識(shí)別、熒光校正（即光學(xué)校正）同诫、phasing/prephasing（即化學(xué)校正）粤策、堿基識(shí)別、PF（Illumina默認(rèn)的數(shù)據(jù)過濾算法Pass Filtering）误窖、質(zhì)量評(píng)估等7個(gè)步驟
其中相機(jī)識(shí)別堿基的工作原理：利用了CCD相機(jī)(1)對(duì)每一個(gè)簇(cluster)進(jìn)行識(shí)別掐场，確定其坐標(biāo)；(2)提取每個(gè)簇分別在A贩猎、G熊户、C、T四個(gè)波長的信號(hào)強(qiáng)度值吭服。另外拍照過程相當(dāng)耗時(shí)嚷堡，一次循環(huán)所產(chǎn)生的信號(hào)需要40分鐘左右才能拍照收集完畢。使用相機(jī)的掃描功能會(huì)更快一些艇棕。
總之蝌戒，根據(jù)設(shè)計(jì)的接頭以及引物結(jié)合位點(diǎn)，一次完成正義鏈沼琉、index及反義鏈的測(cè)序北苟。當(dāng)然，獲得測(cè)序數(shù)據(jù)后的質(zhì)控又涉及其他知識(shí)打瘪，關(guān)于質(zhì)控結(jié)果的解釋也需要認(rèn)真學(xué)習(xí)友鼻。
