劉小澤寫(xiě)于18.11.25
每學(xué)習(xí)一遍之前的知識(shí)，總能從不同角度獲取一些觀(guān)點(diǎn)话侄，然后擴(kuò)增自己的知識(shí)庫(kù)亏推，這就是“知識(shí)迭代”
這次我也就是想到哪寫(xiě)到哪，把自己認(rèn)為重要的內(nèi)容梳理下年堆，用Q&A的形式展示吞杭，沒(méi)想到測(cè)序內(nèi)容這么多，所以先當(dāng)作第一部分吧
測(cè)序相關(guān)
Q1：生物體內(nèi)的DNA的ATCG核苷酸是怎么轉(zhuǎn)換成計(jì)算機(jī)識(shí)別模式的嘀韧？
首先要區(qū)分
這是ATCG的化學(xué)結(jié)構(gòu)篇亭，其中A、G結(jié)構(gòu)類(lèi)似锄贷，屬于嘌呤類(lèi)译蒂；C、T（U）結(jié)構(gòu)類(lèi)似谊却，屬于嘧啶類(lèi)柔昼，我們測(cè)序的目的就是區(qū)別這幾種結(jié)構(gòu)。人類(lèi)基因組中有30億個(gè)堿基炎辨，要想?yún)^(qū)分其中的四類(lèi)堿基捕透，一個(gè)個(gè)分析結(jié)構(gòu)肯定不靠譜，于是想到了使用顏色進(jìn)行區(qū)分，也就是“光信號(hào)”方法
Sanger測(cè)序乙嘀、Illumina末购、454等都是利用光信號(hào)。
光信號(hào)方法就是要讓每個(gè)堿基帶上顏色虎谢，就需要給每種堿基帶上特定的熒光基團(tuán)盟榴，熒光基團(tuán)在測(cè)序儀激光作用下被激發(fā)，發(fā)出的光被照相機(jī)記錄下來(lái)婴噩，然后熒光基團(tuán)失效擎场，接著加下一個(gè)堿基（利用了illumina的“可逆阻斷終止技術(shù)”，簡(jiǎn)而言之几莽，就是：在堿基3‘端加一個(gè)阻斷基團(tuán)迅办，當(dāng)聚合成功之后，就不能在繼續(xù)3‘端加其他堿基了章蚣，這時(shí)利用激光捕獲熒光信號(hào)站欺，之后切掉熒光基團(tuán)和阻斷基團(tuán)，讓下一個(gè)帶熒光的堿基繼續(xù)進(jìn)行）究驴。
另外還可以用“電信號(hào)” （例如英國(guó)牛津納米孔公司ONT的MinION測(cè)序儀以及18年被illumina以12億美金收購(gòu)的太平洋生物公司的SMRT技術(shù)）镊绪。基本思想就是：4種堿基結(jié)構(gòu)不同洒忧，帶的電荷就不同蝴韭，在聚合的過(guò)程中，讓它們通過(guò)電極熙侍，產(chǎn)生不同的電信號(hào)榄鉴，利用電信號(hào)來(lái)區(qū)分【不過(guò)這種測(cè)序裝置的靈敏度要求要比光信號(hào)更嚴(yán)格，才可以檢測(cè)微小的電信號(hào)差別】
然后要規(guī)模
早起Sanger測(cè)序是利用了“末端終止技術(shù)”蛉抓，這樣準(zhǔn)確但是效率比較低庆尘，因此illumina開(kāi)發(fā)了“邊合成邊測(cè)序”，每合成一次就可以讀取一個(gè)堿基巷送，并且合成越長(zhǎng)驶忌，測(cè)序讀長(zhǎng)就越長(zhǎng)。這種技術(shù)就需要利用PCR進(jìn)行大規(guī)模的擴(kuò)增笑跛，但是我們知道付魔，PCR技術(shù)收到酶活性的影響是有合成限制的，不可能無(wú)限擴(kuò)增下去飞蹂，illumina給出的解決方案就是：“雙末端測(cè)序” 几苍，就是正向測(cè)一段，反向再測(cè)一段陈哑，這樣就在PCR循環(huán)一定的情況下妻坝，增加了測(cè)序讀長(zhǎng)
Q2：測(cè)序的基本流程是怎樣的伸眶？
以常用的illumina二代測(cè)序?yàn)槔篌w分為：建庫(kù)刽宪、cluster厘贼、測(cè)序三步
建庫(kù)之前：首先進(jìn)行DNA樣本的質(zhì)量檢測(cè)【1. 最好取單倍體（二倍體或多倍體有等位的雜合位點(diǎn)，測(cè)序時(shí)不容易分區(qū)哪種時(shí)物種真實(shí)存在的雜合位點(diǎn)纠屋，哪種時(shí)測(cè)序錯(cuò)誤導(dǎo)致的假陽(yáng)性 ）涂臣；2. DNA純度要達(dá)到OD值要求（也就是DNA不能混雜蛋白質(zhì)，對(duì)人和動(dòng)物最好用紅細(xì)胞提取DNA ）售担；3. DNA樣本不能降解（因?yàn)闇y(cè)序時(shí)需要對(duì)樣本進(jìn)行隨機(jī)打斷，一般來(lái)講署辉，DNA越長(zhǎng)族铆，打斷的隨機(jī)性就越高，比如15K序列打斷成500bp文庫(kù)哭尝，這樣打斷的組合方式就很多哥攘，但1K的序列打斷成500bp文庫(kù)，組合方式就很少材鹦。如果降解成小片段逝淹，就無(wú)法進(jìn)行隨機(jī)打斷）；4. 測(cè)序量要夠桶唐，能滿(mǎn)足建庫(kù)要求（測(cè)序的數(shù)據(jù)量是由加入的樣本量決定的栅葡，并且為了重復(fù)需要保存?zhèn)浞荩?/p>
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建庫(kù)： 先理解“文庫(kù)”（它是DNA片段的集合，將測(cè)序DNA隨機(jī)打斷就構(gòu)成了DNA文庫(kù)）尤泽。建庫(kù)的過(guò)程可以想象成是硬盤(pán)格式化欣簇，出廠(chǎng)的硬盤(pán)（也就是未處理的樣本DNA）直接插入計(jì)算機(jī)（測(cè)序儀）是不被識(shí)別的，需要分區(qū)掛載（也就是檢測(cè)坯约、打斷熊咽、加接頭等操作）后才可以。
第一步：隨機(jī)打斷
這時(shí)的DNA是一條很長(zhǎng)的片段（比如幾百K的片段）闹丐，使用機(jī)械法横殴、酶接法、超聲波（常用）卿拴，然后設(shè)置打斷的大小如500bp衫仑，然后這個(gè)長(zhǎng)DNA就會(huì)斷成許多的500bp的短片段，就形成了500bp左右的文庫(kù)（需要注意：這里的500bp表示大部分片段在500bp左右巍棱，但并非每條片段都正正好好是500bp惑畴，可以存在400bp或者700bp）【常見(jiàn)的文庫(kù)還有170bp文庫(kù)、350bp文庫(kù)航徙、800bp如贷、2K、5K、6K等】一般1K以下屬于小片段文庫(kù)杠袱，1K以上是大片段文庫(kù)尚猿。文庫(kù)大小的值又叫作“插入片段長(zhǎng)度 Insert size”（這個(gè)值很重要，在序列拼接楣富、短序列比對(duì)中會(huì)經(jīng)常用到）第二步：電泳
將一定范圍內(nèi)的DNA進(jìn)行回收凿掂，如果要500bp文庫(kù)，可以回收300-800bp的膠第三步：3‘加A
在3‘加上一個(gè)A堿基纹蝴，將原來(lái)平末端變成粘性末端庄萎，更容易在后續(xù)過(guò)程中連接引物和接頭第四步：加index標(biāo)簽
這是一個(gè)6-8bp的堿基片段，用于區(qū)分不同的測(cè)序樣本√涟玻現(xiàn)在測(cè)序一條lane 能產(chǎn)生30G以上的數(shù)據(jù)糠涛，但是有的物種DNA沒(méi)這么大，為了減少機(jī)器空轉(zhuǎn)兼犯，可以將不同物種的DNA混合起來(lái)進(jìn)行測(cè)序忍捡，但是下機(jī)后如何區(qū)分提交給客戶(hù)呢？這就需要利用標(biāo)簽第五步：加接頭
加接頭目的是將測(cè)序片段固定（或者叫“種”切黔，種花的zhong）在flowcell的lane上砸脊，防止被測(cè)序的液體沖走。接頭包括：P7接頭纬霞、P5接頭凌埂，其中P7接頭和lane上的一樣，P5和lane上互補(bǔ)险领，這樣的目的是為了后面的橋式擴(kuò)增
cluster： 這個(gè)詞是“簇”的意思侨舆，也就是富集序列。因?yàn)闇y(cè)序需要熒光信號(hào)绢陌，如果僅對(duì)一條序列進(jìn)行檢測(cè)挨下，那么信號(hào)很弱，識(shí)別錯(cuò)誤率會(huì)很高脐湾，如果對(duì)一簇相同的序列同時(shí)檢測(cè)某個(gè)位點(diǎn)的光信號(hào)玫鸟，那么準(zhǔn)確度就大大提高
這個(gè)過(guò)程就是“橋式PCR”藐窄，原來(lái)一條鏈以指數(shù)增長(zhǎng)成為一簇“克隆”
序列條數(shù)x測(cè)序讀長(zhǎng)=一次測(cè)序量測(cè)序：加入dNTP（與橋式PCR中加的普通dNTP不同，它的3‘被疊氮基團(tuán)修飾）、聚合酶附井。先從cluster同一條鏈的第一個(gè)堿基開(kāi)始測(cè)建邓，再到第n個(gè)堿基炊昆，直到測(cè)完整條鏈芒篷，得到reads1【注意這里才正式出現(xiàn)了reads這個(gè)名詞，意思就是：一個(gè)堿基一個(gè)堿基讀取】
測(cè)完reads1孟岛，加入堿性溶液將剛才測(cè)序完的鏈解鏈沖掉瓶竭，加再入第二種測(cè)序引物督勺，正好reads2的測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn)在index序列旁，先讀取6-8個(gè)堿基測(cè)得index序列斤贰；
然后合成原來(lái)測(cè)序鏈的互補(bǔ)鏈智哀，并切除原來(lái)測(cè)序鏈，還是按照原來(lái)方法測(cè)的reads2
測(cè)序完成后并沒(méi)有得到想要的ATGC堿基順序荧恍，而是一堆照片瓷叫，下面就是圖像處理轉(zhuǎn)換成有顏色的光點(diǎn)文件（二進(jìn)制BCL文件，即basecalling）送巡，其中包括測(cè)序儀編號(hào)摹菠、run序號(hào)、lane序號(hào)骗爆、tile號(hào)辨嗽、X/Y坐標(biāo)、index淮腾、reads1/2、堿基序列屉佳、質(zhì)量序列谷朝、是否通過(guò)質(zhì)量過(guò)濾（1為通過(guò)；0表示質(zhì)量差）
Q3：已經(jīng)知道文庫(kù)有大片段文庫(kù)（1K以上）和小片段文庫(kù)武花，文庫(kù)多大就能測(cè)多大嗎圆凰？另外測(cè)序是雙端測(cè)150bp左右，那么中間還有一部分沒(méi)有測(cè)到体箕，這樣會(huì)不會(huì)有問(wèn)題专钉？基因組上的這部分區(qū)域會(huì)被忽略嗎？
首先累铅，不管構(gòu)建多大的文庫(kù)跃须，測(cè)序得到的都是兩端很短的序列（比如雙端150就是得到兩個(gè)150bp的reads）；
其次中間測(cè)不通并不會(huì)有問(wèn)題娃兽，而且是非常正常的現(xiàn)象菇民！因?yàn)槲膸?kù)構(gòu)建是隨機(jī)打斷過(guò)程，所以即使第一條片段中間沒(méi)有被測(cè)到也沒(méi)關(guān)系投储，后面的其他片段一定能測(cè)到這中間的部分（因?yàn)橐淮螠y(cè)序過(guò)程會(huì)產(chǎn)生成百上千萬(wàn)條reads第练，而基因組就那么大）
另外，你可能會(huì)想：既然只能測(cè)兩端很短的一部分玛荞，那么小片段和大片段文庫(kù)的區(qū)別在哪娇掏？反正都測(cè)不完。其實(shí)勋眯，大片段文庫(kù)的目的婴梧，除了得到序列以外下梢，更重要的是，為了獲取片段的坐標(biāo)距離（即兩條reads之間的物理距離關(guān)系志秃，將會(huì)為序列拼接和基因組結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)提供幫助） 怔球。當(dāng)然，目前大片段文庫(kù)還有一些問(wèn)題浮还，比如現(xiàn)在PCR手段不能擴(kuò)增太長(zhǎng)的片段竟坛，另外我們只能測(cè)兩側(cè)的很短的片段，那么中間合成出來(lái)卻不能測(cè)钧舌，造成了浪費(fèi)担汤！
但是這些問(wèn)題illumina給出了大片段文庫(kù)的解決辦法：
在隨機(jī)打斷序列后，大片段比小片段文庫(kù)多了一個(gè)環(huán)化處理洼冻，經(jīng)過(guò)末端修復(fù)崭歧，再將一個(gè)線(xiàn)性長(zhǎng)片段頭部進(jìn)行生物素標(biāo)記，再進(jìn)行環(huán)化（即：把片段首尾連接成一個(gè)環(huán)）【我們現(xiàn)在知道了：小片段文庫(kù)是pair end撞牢； 大片段文庫(kù)是mate pair】
曾經(jīng)我也是為這兩個(gè)概念搞的頭暈轉(zhuǎn)向??
關(guān)于大小片段文庫(kù)的差別：
Q4：為什么不能測(cè)完整的基因組率碾？
理想的情況是：基因組有多大，我們就能測(cè)多大
但事實(shí)是：我們提取的DNA就不是完整的一整條屋彪，而是斷成許多片段所宰，比如10M基因組提取出來(lái)，可能也就剩一堆幾百K的片段⌒蠡樱現(xiàn)在可以做的就是對(duì)這些幾百K的片段隨機(jī)打斷測(cè)序仔粥；另外，目前二代測(cè)序基本都依賴(lài)PCR擴(kuò)增蟹但，因此限制了讀長(zhǎng)
Q5: 目前市面上一二三代測(cè)序并存躯泰，怎么選擇？
存在即合理华糖，因?yàn)闆](méi)有任何一種測(cè)序技術(shù)能勝任任何工作麦向，才會(huì)出現(xiàn)現(xiàn)在的局面。對(duì)于選擇困難癥患者來(lái)講缅阳，一般可以從測(cè)序讀長(zhǎng)磕蛇、通量、準(zhǔn)確性十办、價(jià)格角度考慮
所以也能理解秀撇，為什么illumina是目前的龍頭，另外收購(gòu)Pacbio后它在三代的市場(chǎng)又可以一展拳腳了
Q6: GC bias是什么意思向族？
基因組正常的GC含量是35-65%呵燕，如果小于35%或者大于65%就屬于異常。我們知道AT是2個(gè)氫鍵連接件相，而GC是3個(gè)氫鍵再扭，因此如果GC含量太高氧苍，在PCR過(guò)程中解鏈需要的能量更高，導(dǎo)致模版鏈更難打開(kāi)泛范，默認(rèn)的溫度下让虐，DNA模版變性不完全；另外PCR產(chǎn)物難易結(jié)合到模版罢荡，DNA聚合酶也難以延伸赡突，結(jié)果就是出現(xiàn)非特異性條帶，不容易被擴(kuò)增区赵，因此也無(wú)從談及測(cè)序惭缰，最后基因組覆蓋不均勻，丟失部分信息
對(duì)于這樣的樣品笼才，可以構(gòu)建PCR-free文庫(kù) 漱受，但需要更多樣本量
Q7: 關(guān)于讀長(zhǎng)、插入片段大小的選擇
我們知道了小片段測(cè)序文庫(kù)中有多種規(guī)格可供選擇骡送，如：170bp昂羡、350bp、500bp摔踱、700bp等紧憾。讀長(zhǎng)的話(huà)，在保證準(zhǔn)確性前提下昌渤，越長(zhǎng)越好，有利于序列拼接憔四。例如Miseq可以實(shí)現(xiàn)PE 300bp的讀長(zhǎng)膀息，如果選擇500bp文庫(kù)和Miseq PE300（效果可以和454差不多了），那么中間就會(huì)有100bp重疊區(qū)域了赵，發(fā)生了所謂的“片段測(cè)通”潜支，可以利用這個(gè)區(qū)域?qū)蓚€(gè)reads拼接起來(lái)，形成更長(zhǎng)的序列柿汛。
文庫(kù)大小需要和reads讀長(zhǎng)相協(xié)調(diào)冗酿，對(duì)于較短的測(cè)序片段，文庫(kù)不能過(guò)大络断；對(duì)于De novo 拼接裁替，可以先使用小片段文庫(kù)，然后轉(zhuǎn)為大片段文庫(kù)貌笨，并逐級(jí)增加文庫(kù)大小如2K弱判、6K、10K锥惋、20K等【目的就是合理使用重疊區(qū)域進(jìn)行逐級(jí)拼接】
Q8：為什么小片段文庫(kù)如500bp需要兩端分別測(cè)昌腰，而不能一次測(cè)通500bp呢开伏？
利用PCR反應(yīng)是可以實(shí)現(xiàn)的，就是一直擴(kuò)增遭商，把500bp全部測(cè)出來(lái)固灵。不能這么做的一個(gè)因素是：PCR中DNA聚合酶的活性會(huì)下降，因此測(cè)序錯(cuò)誤率會(huì)隨著測(cè)序長(zhǎng)度增加而增加 劫流；另外一個(gè)因素就是Phasing巫玻，按說(shuō)cluster中所有片段都要保持同步，第一次大家都加第一個(gè)堿基困介，第二次都加第二個(gè)堿基… 但實(shí)際上大审，總有幾個(gè)走的快或者走的慢（一次加兩個(gè)堿基或者這一次一個(gè)堿基也沒(méi)加），這些“離群”的堿基出來(lái)的熒光值就會(huì)帶給整體干擾
Q9：不同的測(cè)序座哩，不同的操作徒扶？
對(duì)于全基因組測(cè)序，就是按上面的測(cè)序步驟就好根穷；
對(duì)于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序姜骡，就需要考慮RNA反轉(zhuǎn)錄的問(wèn)題，那么是先反轉(zhuǎn)錄再打斷還是先打斷后反轉(zhuǎn)錄呢屿良？ 其實(shí)比較高效的方法是：先反轉(zhuǎn)錄后打斷圈澈。一般轉(zhuǎn)錄本比較短（小于2K），那么選擇文庫(kù)時(shí)就不能太大（比如尘惧，不能選800bp文庫(kù)康栈，因?yàn)?K的序列，打斷成800喷橙，隨機(jī)性不是很好）啥么，可以考慮小一些的文庫(kù)（300左右）
另外還有很多測(cè)序類(lèi)型：外顯子組、甲基化贰逾、小RNA悬荣、宏基因組等
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