研究概述：肝細胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌類型析命，也是全球癌癥相關死亡的第二大原因。HCC相關的高死亡率很大程度源于其高轉移性逃默，腫瘤轉移表現為腫瘤細胞從原發(fā)病變部位通過基底膜(basal membrane, BM)向遠處器官滲透鹃愤，形成新的轉移灶,基底膜的重塑或損失(BM)是腫瘤細胞實現轉移的重要因素。TME與腫瘤發(fā)生完域、腫瘤細胞逃離免疫系統软吐，以及腫瘤的療效和臨床預后密切相關，腫瘤轉移累及BM的機制已被證明與TME密切相關吟税。盡管肝癌的靶向治療和免疫治療取得了進展凹耙，但晚期HCC的耐藥性高和有限的療效問題姿现，急需更好的治療選擇和早期診斷生物標志物。雖然有重要的研究調查了TME對肝癌的影響肖抱，但免疫細胞是否可以通過機械修飾BM來增強HCC的侵襲仍未完全了解备典。為此，作者旨在通過尋找和評估潛在基底膜與轉移相關的生物標志物來解決這些空白意述，以改善HCC患者的生存結果和治療效果提佣。本研究首先收集了來自TCGA的424例HCC患者和ICGC數據庫的240例HCC患者的轉錄組測序、臨床和突變數據荤崇，基于轉移和基底膜相關基因(base membrane-related genes, MBRGs)拌屏，利用大量數據分析，構建并驗證了一個由12個基因組成的肝癌預后模型术荤。然后倚喂，使用免疫相關算法來檢查高風低風險組的肝癌免疫微環(huán)境情況，并進一步分析免疫治療的敏感性瓣戚。此外端圈，使用肝癌單細胞RNA測序結果，分析了其中一個MBRGs——整合素亞單位α 3 (ITGA3)在HCC中的表達带兜。最后枫笛，通過相關細胞實驗來闡明ITGA3在人肝癌HepG2細胞侵襲中的新作用。下圖為其研究工作流程圖：

研究結果如下：

1.基于轉移和基底膜相關基因刚照，鑒定出12個肝癌相關預后基因

研究從TCGA數據庫中獲得了424例TCGA-LIHC患者樣本(374例腫瘤和50例正常)刑巧，包含59,427個基因(FPKM)，采用log2 |Fold change|≥1和FDR < 0.05的篩選標準進行腫瘤組和正常組的方差差異分析无畔，獲得TCGA-LIHC中獲得了13095個差異基因（DEGs）啊楚。另外從HCMDB數據庫中獲得了2165個轉移基因，從先前的研究中獲得了224個BM基因浑彰，然后對TCGA-LIHC中13095個差異基因恭理、2165個轉移基因和224個BM基因進行交叉分析，得出35個在肝癌中共表達的與轉移和基底膜相關基因（圖2A）郭变。35個基因中颜价，32個基因上調，3個基因下調(圖2B)诉濒。隨后周伦，對這35個差異表達的轉移與BM交叉基因進行單因素Cox回歸分析，鑒定出12個預后基因未荒，均與OS顯著相關专挪，HCC的風險比均> 1(p < 0.05)。此外，12個預后基因在腫瘤組織中表達上調(圖2C, D)寨腔。結果提示12個預后基因的高表達預示著不良的預后速侈。接下來，評估HCC預后基因的突變狀態(tài)和CNVs的發(fā)生率迫卢，在371例HCC病例中倚搬，35例(9.43%)發(fā)生轉移和腦轉移相關基因突變，包括ROBO1(3%)靖避、ITGB5(2%)潭枣、ITGAM(1%)、ITGA3(1%)幻捏、ITGAV(1%)盆犁、ITGA2(1%)和MMP14(1%)(圖2E)。此外篡九，CNVs在大多數預后基因中普遍存在谐岁。其中，ITGA3和ITGA2主要被擴增榛臼，ADAM9伊佃、ITGAM、MMP1和MMP14主要被缺失(圖2F) 沛善。

2.基于TCGA數據庫構建MBRG預后評估模型

利用單變量Cox回歸分析得到的12個預后基因航揉，我們進一步利用多變量Cox回歸分析建立了基于這12個MRBGs的預后模型，風險評分采用下式計算金刁，其中exp.表示相應MBRG的表達水平:Riskcore =(0.556?UNC5B exp.)+ 0.1291(?ROBO1 exp.)+ 0.1482(?MMP14 exp.)+ 0.7548(?MMP1 exp.)+ 0.3003(?ITGB5 exp.)+ 0.4213(?ITGAV exp.)+(?0.2984?ITGAM exp.)+(?0.3605?ITGA5 exp.)+(?0.7239?ITGA3 exp.)+(?0.1902?ITGA2 exp.)+ 0.9724(?CD151 exp.)+ 0.6254(?ADAM9 exp.)帅涂，使用風險評分中位數,我們分類的病人到低收入和高危人群。在TCGA數據集中尤蛮，我們觀察到低危組的生存期明顯長于高危組(圖3A)媳友。此外， ROC曲線顯示产捞，基于MBRGs的預后模型具有較高的可靠性醇锚，1年、2年和3年的曲線下面積(AUC)分別為0.749坯临、0.714和0.706生存率分別為(圖3B)焊唬。風險評分和生存狀態(tài)分析顯示，低風險組表現出良好的生存結果看靠，生存期延長求晶。此外，所有風險基因在高危亞組中均上調(圖3C)衷笋。PCA和t-SNE分析顯示，兩個亞組的患者進一步分為兩種分布模式(圖3D)。這些結果表明辟宗，MBRGs預后模型可用于準確預測HCC患者的臨床發(fā)展軌跡爵赵。

3.ICGC數據庫中MBRGs預后模型的驗證

采用ICGC數據庫中的LIHC-JP隊列作為驗證組，評估MBRG預后模型在訓練隊列中的普遍性泊脐，利用上述TCGA隊列相同的公式計算驗證隊列中每位患者的風險評分空幻。結果顯示，高危組患者的生存狀況明顯差于低危組(p = 0.001)(圖3E)容客。此外秕铛，ROC分析顯示，MBRG預后模型的1年缩挑、2年和3年生存率的AUC值分別為0.728但两、0.731和0.683(圖3F)。風險評分與生存狀態(tài)分析供置，12個基因的表達高組其風險評分增加和死亡率升高 (圖3G)谨湘。PCA和t-SNE在兩個風險亞組之間顯示出明顯的方向性分布。

4.MBRGs預后模型與臨床特征的相關性分析

進一步分析MBRGs預后模型在TCGA隊列中不同臨床因素分組中的價值芥丧，腫瘤分級紧阔、分期、T期越高患者風險評分較高(p < 0.05)(圖4A-C)续担。此外擅耽，我們發(fā)現高危組更容易發(fā)生血管侵犯(p < 0.05)(圖4D)，并且在淋巴結陽性和遠處轉移的患者中觀察到風險評分增加的趨勢(圖4E, F)物遇。

5.風險評分的獨立預后分析和預測模態(tài)圖模型的構建

采用單因素和多因素Cox分析探討LIHC的獨立預后因素,結果顯示乖仇，風險評分和分期與OS顯著相關，提示TCGA-LIHC隊列構建的MRBG預后模型的風險評分是HCC患者的獨立預后因素(p < 0.01)(圖5A, B)挎挖。因此这敬，我們創(chuàng)建了一個基于HCC獨立預測指標的模態(tài)(圖5C)來更準確地評估患者預后。此外蕉朵，校準曲線(1年崔涂、2年和3年)在模態(tài)圖的內部驗證中表現出良好的性能(圖5D)。如圖5E始衅、F所示冷蚂，模型與臨床信息相結合具有較好的預測能力，AUC為0.790汛闸◎瑁總之，將基于MBRGs的HCC患者預后模型與臨床信息相結合诸老，成功構建了具有更高可信度和準確性的預后模型隆夯。

6.HCC的MBRGs評分與EMT活動呈正相關

在內皮間質轉化過程(EMT)中發(fā)生的BM丟失被認為是腫瘤轉移和惡性發(fā)展的關鍵步驟，這促使我們研究MBRGs評分與EMT途徑之間的相關性。KEGG和GO富集分析顯示蹄衷，先前鑒定的DEGs在許多與免疫和腫瘤轉移相關的途徑中顯著富集(圖6A-B)忧额。在GSEA中，高危亞組主要富集于細胞增殖相關通路愧口，低危組主要富集于細胞代謝相關通路(圖6C)睦番。這些結果揭示了基底膜在HCC進展和轉移中的重要性。值得注意的是耍属，GSEA結果提示高危亞組預后不良的主要原因是細胞增殖托嚣。最后，散點圖的相關分析顯示厚骗，EMT通路與MBRG ITGA3的表達之間存在很強的正相關(圖6D)示启。

7.不同組LIHC患者的免疫學分析

為了進一步探討MBRG s評分與免疫狀態(tài)的相關性，我們使用ssGSEA評估了TCGA高危組和低危組16種免疫細胞類型的富集評分溯捆，結果顯示免疫細胞浸潤在兩個亞組之間存在顯著差異丑搔，如激活的樹突狀細胞、樹突狀細胞提揍、巨噬細胞和Tregs在高危亞組中顯著富集啤月，而B細胞、肥大細胞劳跃、自然殺傷(NK)細胞和其他免疫細胞在低危亞組中主要富集(p < 0.05)(圖7A)谎仲。此外，在免疫功能方面刨仑，高危組MHC_I水平較高郑诺，低危組細胞殺傷活性和II 型干擾素水平較高(p < 0.05)(圖7B)。此外杉武，ITGA3的表達與巨噬細胞辙诞、Tregs等多種免疫細胞和免疫功能呈正相關(p < 0.05)(圖7C-E)。這些結果揭示了ICGC和TCGA隊列之間相似的免疫狀態(tài)轻抱，提示高危組患者預后不良可能是由腫瘤相關巨噬細胞狀態(tài)和Treg水平高以及NK細胞水平低引起的飞涂。

8.基于MBRGs評分，進行腫瘤突變負荷和免疫治療反應等評估

考慮到腫瘤突變負荷（TMB）值祈搜、腫瘤免疫功能障礙和排斥(TIDE)評分较店、突變頻率、免疫檢查點基因表達與免疫治療的療效密切相關容燕，在高危組和低危組均基于MRBGs進行估計梁呈。TMB量化分析顯示，高危組TMB值更高(圖8A)蘸秘。如圖8B所示官卡，高危組的TIDE評分較低蝗茁，表明免疫障礙的可能性較低。隨后味抖，我們使用“mafTools”R包進一步研究了前15個基于TCGA的體細胞突變在高评甜、低風險組之間的分布格局(p < 0.01)。TP53是兩個亞組中最常見的突變基因仔涩，高風險組的突變頻率比低風險組高18%(圖8C, D)。此外粘舟，TTN熔脂、LRR1B和OBSCN在高風險組中顯著上調，CTNNB1在低風險組中顯著下調柑肴∠既啵總的來說，高風險組在所有因素中有更高的突變頻率晰骑，表明免疫治療有更大的影響适秩。此外，對免疫檢查點阻斷因子在高危組和低危組之間表達差異的進一步研究顯示硕舆，PD-1秽荞、CTLA4和PD-L1在高危組中高表達(p < 0.05)(圖8E)。綜上所述抚官，高危組TMB值較高扬跋，突變頻率較高，免疫檢查點基因表達增加凌节，TIDE評分較低钦听，提示高危組可能具有更好的免疫治療效果。

9.基于MBRGs進行肝癌治療藥物敏感性分析

為了確定HCC患者的潛在治療藥物倍奢，我們使用算法來探索HCC患者的MBRGs風險評分與四種常用抗癌藥物(阿西替尼朴上、安洛替尼、索拉非尼和蘇尼-替尼)的反應之間的相關性卒煞。通過計算這些藥物在低風險組和高風險組中的IC50值痪宰，發(fā)現低風險組患者對阿西替尼、厄洛替尼和索拉非尼表現出更大的敏感性跷坝，而高風險組患者對舒尼替尼的敏感性增加(圖9A)酵镜，IC50值與阿西替尼、厄洛替尼柴钻、索拉非尼與風險評分正相關淮韭，以及舒尼替尼的IC50值與風險評分之間呈負相關(p < 0.001)。此外贴届，我們從Drugbank數據庫中獲得了靶基因靠粪，并基于靶向治療評估了它們在兩個危險組中的表達蜡吧，兩組間所有靶基因的表達均有顯著差異(p < 0.05)(圖9B)。這些發(fā)現表明占键，MBRGs風險評分可以區(qū)分哪些患者更適合適當的治療昔善。

10.ScRNA-seq分析及PPI網絡的構建

由前文獲知ITGA3是高預后基因，可能在肝癌發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用畔乙，為了進一步在單細胞水平上探討ITGA3在HCC中的作用君仆，我們由TISCH 2.0數據庫收集了肝癌組織的scRNA-seq分析，結果示了ITGA3在惡性肝細胞中的高表達（圖10A-F）牲距。惡性細胞中ITGA3的表達水平明顯高于肝細胞返咱，且與HCC預后不良有關。為了闡明蛋白質之間的共表達和相互作用牍鞠，我們選擇了高預后基因ITGA3進行進一步分析咖摹，并使用以該因子為中心的GeneMAINA數據庫構建了PPI網絡，結果示有20種蛋白與ITGA3相互作用难述，其中ITGB1與ITGA3的相關性最高(圖10G)萤晴。

11.ITGA3在HCC細胞的遷移和侵襲中起著至關重要的作用

前文研究揭示了MBRG與EMT通路之間存在很強的正相關，其中ITGA3是相關性最強的MBRG胁后。然而店读，該基因對HCC增殖和遷移的影響尚未見報道。由于ITGA3在HepG2細胞中表達水平較低(圖11A)择同，因此使用過表達載體來分析其在HCC中的潛在作用两入，RT- qPCR結果顯示，轉染ITGA3- oe慢病毒后敲才，ITGA3的表達顯著上調(圖11B)裹纳。CCK-8實驗結果表明，過表達ITGA3不影響HepG2細胞的增殖(圖11C)紧武。接下來剃氧，利用劃痕實驗和Transwell遷移實驗，發(fā)現過表達ITGA3增強了HepG2細胞的遷移能力阻星，侵襲細胞數量明顯增加(圖11D-G)朋鞍。此外，來自HPA數據庫的免疫組化結果顯示妥箕，ITGA3在腫瘤中的表達高于正常組織(圖11H)滥酥。這些結果表明，ITGA3在HCC細胞的遷移和侵襲中起著至關重要的作用畦幢。

研究總結：

本研究結合腫瘤轉移和腫瘤轉移兩個特征構建了一種新的生物標志物坎吻，建立了一種基于MBRGs的12個相關基因的肝癌新型預后模型，可有效預測患者的轉移宇葱、預后和免疫治療效果瘦真，有助于指導醫(yī)生為HCC患者制定更準確和個性化的治療決策刊头，并特別提出了ITGA3在HCC細胞的遷移和侵襲中起著至關重要的作用，并有望開發(fā)出新的潛在藥物诸尽，研究結果為肝癌基礎研究提供了新的理論支持原杂。