影響因子：7.5

研究概述：惡性間皮瘤是一種不常見的腫瘤儒将，與石棉暴露有很大關(guān)系，預(yù)后很差对蒲。作者試圖建立一個成纖維細(xì)胞分化相關(guān)基因特征钩蚊，以創(chuàng)建一個新的惡性間皮瘤分類和預(yù)后預(yù)測模型。NCBI-GEO蹈矮、TCGA和MET-500三個數(shù)據(jù)庫分別提供了單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)砰逻、MESO的bulk RNA測序和骨轉(zhuǎn)移腫瘤的RNA測序。利用降維和聚類分析獲得了MESO微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞亞型,結(jié)合擬時序分析和TCGA數(shù)據(jù)庫中的生存信息泛鸟，篩選出與生存相關(guān)的成纖維細(xì)胞分化相關(guān)基因（FDGs）蝠咆，隨后利用這些基因生成MESO分類和預(yù)后預(yù)測模型。然后北滥，為每種MESO亞型構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)刚操，并預(yù)測候選抑制劑。作者收集了臨床標(biāo)本進一步驗證再芋。該研究為今后的研究提供了一些前瞻性的治療靶點菊霜，對推動未來MESO的臨床和基礎(chǔ)研究具有重要意義。

本文的思路是通過單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析識別了某種免疫細(xì)胞特有的marker基因济赎，然后利用這些基因進行預(yù)后模型的構(gòu)建占卧。

研究流程圖如下：

研究結(jié)果：

在腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞

作者從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取了三個MESO樣本（ADU-S100_10um遗菠、ADU-S100_50um和對照組）單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜。經(jīng)過嚴(yán)格過濾和控制后华蜒，共獲得14,347個細(xì)胞用于后續(xù)分析辙纬。為了確定在腫瘤進展過程中可能具有調(diào)控功能的關(guān)鍵基質(zhì)細(xì)胞，作者利用降維分析發(fā)現(xiàn)了腫瘤微環(huán)境中的15個seurat群叭喜，并根據(jù)細(xì)胞標(biāo)志物將其分為七種細(xì)胞類型（B細(xì)胞贺拣、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞捂蕴、成纖維細(xì)胞譬涡、肥大細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和NK/T細(xì)胞）（圖1B啥辨，C）涡匀。

圖1E顯示了細(xì)胞類型標(biāo)記基因的表達(dá)情況，溉知，圖1D顯示了三種樣本中七種細(xì)胞類型的平均數(shù)量和細(xì)胞比例陨瘩，其中上皮細(xì)胞數(shù)量最多，其次是NK/T細(xì)胞级乍。在對15個seurat簇的差異表達(dá)分析中舌劳，圖1F展示了各群細(xì)胞的marker基因。隨后玫荣，為了弄清成纖維細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的關(guān)系和相互作用甚淡，作者建立了七種細(xì)胞類型之間的細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)和配體-受體相互作用。

在三個MESO樣本中捅厂，作者發(fā)現(xiàn)了1969個成纖維細(xì)胞（圖2A）贯卦，并通過降維分析和聚類從中得出了六個成纖維細(xì)胞亞型（圖2B）。圖2C顯示了每種亞型中四種細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)水平焙贷。除了成纖維細(xì)胞的典型標(biāo)志物DCN和COL1A2外撵割，APOE的表達(dá)也普遍較高。作者以熱圖的形式列出了每個亞型中表達(dá)差異最大的四或五個基因（圖2D）盈厘。

六種亞型之間的細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)和配體-受體相互作用顯示睁枕，KRT19_FIB和MMP2_FIB在所有亞型中處于中心位置，EFGR與CALM2和ANXA1之間存在緊密聯(lián)系（圖2E沸手，F(xiàn)）外遇。為了進一步探究各亞型的功能，作者利用HALLMARK數(shù)據(jù)庫根據(jù)各成纖維細(xì)胞中基因組的變異評分進行了GSVA分析契吉。結(jié)果顯示跳仿，所有亞型都普遍富集于KRAS通路，而KRT19_FIB和MMP2_FIB的免疫相關(guān)標(biāo)志基因集（標(biāo)IFNG和IFNA）和增殖相關(guān)標(biāo)志基因集（MYC激活）的富集程度相對較高捐晶，這意味著與其他亞型相比菲语，這兩種亞型可能具有更高的增殖潛力（圖2G）妄辩。因此，在所有六個亞型中山上，KRT19_FIB和MMP2_FIB更值得關(guān)注眼耀。

成纖維細(xì)胞亞型的分化狀態(tài)和與分化相關(guān)的成纖維細(xì)胞差異基因（FDGs）

作者在此過程中使用了Monocle 2和tSNE，通過識別4個tSNE細(xì)胞簇使成纖維細(xì)胞的分化軌跡得以直觀呈現(xiàn)佩憾。圖3A顯示了按時間順序排列的分化軌跡哮伟，顏色的漸變代表了細(xì)胞分化所需的時間。共捕捉到三種分化狀態(tài)妄帘，其中狀態(tài)1是最早的階段楞黄，然后分為狀態(tài)2和狀態(tài)3（圖3B）。六種亞型在軌跡中的分布情況見圖3C抡驼、D鬼廓。IGF2_FIB、LARP6_FIB和MYL9_FIB主要位于狀態(tài)3致盟，意味著相對成熟的分化碎税，而KRT19_FIB和PTPRC_FIB則主要分布在狀態(tài)1，即低分化階段勾邦。因此蚣录，KRT19_FIB中成纖維細(xì)胞的分化程度可能較低割择。

隨后眷篇，作者為了捕捉六個亞型中與分化相關(guān)的成纖維細(xì)胞差異基因（FDGs）。先通過Monocle2單細(xì)胞分析工具集荔泳，作者提取了644個在三種分化狀態(tài)下有差異表達(dá)的基因蕉饼。又在TCGA數(shù)據(jù)庫記錄的大量RNA-seq數(shù)據(jù)和MESO患者臨床信息的基礎(chǔ)上，利用Kaplan-Meier技術(shù)和單變量Cox回歸模型進行生存分析玛歌，檢測與生存相關(guān)的基因昧港。將得到的三個基因集重疊，篩選出三個基因集交叉點上的共39個基因支子，并將其定義為成纖維細(xì)胞分化相關(guān)基因（FDGs）创肥。根據(jù)這39個FDGs的生存曲線，ADH1B值朋、CFB叹侄、PRG4、PLAAT4昨登、HP和IFIT3的高表達(dá)對生存有利趾代，而其他33個基因被認(rèn)為是危險因素。更重要的是丰辣，6個有利因素中的5個（CFB撒强、PRG4禽捆、PLAAT4、HP和IFIT3）在狀態(tài)3中有所體現(xiàn)飘哨，因為與狀態(tài)1相關(guān)的16個FDGs都被標(biāo)記為風(fēng)險因素（圖4A）胚想。因此，作者推斷芽隆，在MESO腫瘤微環(huán)境中顿仇，分化程度高的成纖維細(xì)胞可能有助于改善預(yù)后，而分化程度低的成纖維細(xì)胞可能產(chǎn)生相反的效果摆马。根據(jù)這一推斷臼闻，KRT19_FIB可能與不良預(yù)后有關(guān)。

構(gòu)建基于成纖維細(xì)胞分化的MESO分類（FDBC）

通過擬時序分析來確定連續(xù)細(xì)胞發(fā)育過程中基因表達(dá)的動態(tài)變化囤采，作者試圖探索成纖維細(xì)胞的不同分化狀態(tài)和各亞型的分化特征述呐。為了探索FDGs的臨床價值，作者從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取了MESO患者的bulkRNA-seq數(shù)據(jù)和臨床信息蕉毯，并根據(jù)FDGs的表達(dá)情況乓搬，利用共識聚類將這些患者分為不同的分類。結(jié)合共識聚類矩陣熱圖代虾、CDF曲線和delta面積圖进肯，認(rèn)為3是最佳k值，可產(chǎn)生三個聚類（圖4B棉磨、C）江掩。如圖4D所示，聚類1高表達(dá)狀態(tài)1和狀態(tài)2的基因乘瓤，而聚類2則相對高表達(dá)狀態(tài)3的基因（包括CFB环形、PRG4、PLAAT4衙傀、HP和IFIT3）抬吟，這表明聚類1可能與低分化成纖維細(xì)胞有關(guān)，而聚類2中的成纖維細(xì)胞則趨向于高分化统抬。

所有FDGs的差異表達(dá)均有統(tǒng)計學(xué)意義火本。因此，作者將第1群組命名為"低度分化的成纖維細(xì)胞相關(guān)間皮瘤（LDFM）"聪建，第2群組命名為"高度分化的成纖維細(xì)胞相關(guān)間皮瘤（HDFM）"钙畔，第3群組命名為"中度分化的成纖維細(xì)胞相關(guān)間皮瘤（MDFM）"。在這三個群組中妆偏，HDFM的生存結(jié)果明顯優(yōu)于LDFM和MDFM刃鳄，而LDFM的生存結(jié)果最差，體現(xiàn)了新分類的預(yù)后價值（圖4E）钱骂。作者根據(jù)39個FDGs進一步計算了每位患者的PCA得分叔锐，并將患者分為兩個PCA組（低分組和高分組）挪鹏。由于高分組患者的生存概率普遍高于低分組患者，因此PCA評分可能與生存率呈正相關(guān)（圖4F）愉烙。同時讨盒，作者發(fā)現(xiàn)HDFM患者的PCA評分普遍高于LDFM和MDFM（圖4G）。LDFM中的所有患者都流向了低分組步责，而HDFM中的高分組占了很大比例返顺。因此，新的分類方法可能是預(yù)后預(yù)測的有效指標(biāo)蔓肯，從而改善患者管理遂鹊。

新型預(yù)后預(yù)測模型的建立和內(nèi)部驗證

如圖5A所示，作者從FDGs中識別出了9個MSigDB基因類別和相應(yīng)的42條通路蔗包。根據(jù)基因表達(dá)與相關(guān)總生存率（OS）之間的單變量Cox回歸分析秉扑，圖5B展示了具有統(tǒng)計學(xué)意義的6個保護因素（ADH1B、CFB调限、PRG4舟陆、PLAAT4、HP和IFIT3）和33個危險因素耻矮。為了充分利用FDGs與生存之間的關(guān)系秦躯，作者應(yīng)用Lasso回歸分析法從這些FDGs中選擇最佳基因構(gòu)建預(yù)后預(yù)測模型，減少偏倚裆装，最終將6個關(guān)鍵FDGs納入風(fēng)險評分公式踱承。在六種關(guān)鍵FDGs中，ADH1B和PLAAT4（保護因子）在低風(fēng)險組中的表達(dá)量普遍較高米母，而CDC20勾扭、CKS2毡琉、IPT1和LDLR（危險因子）在高風(fēng)險組中的表達(dá)量相對較高（圖5C）铁瞒。

此外，如圖5D所示桅滋，作者對年齡慧耍、性別、分期丐谋、骨轉(zhuǎn)移和風(fēng)險評分進行了單變量和多變量Cox回歸分析芍碧，結(jié)果表明風(fēng)險評分可被視為獨立于這些臨床指標(biāo)的預(yù)后因素。通過比較低危組和高危組的一些臨床特征号俐，作者發(fā)現(xiàn)盡管兩組死亡率都很高泌豆，但低危組存活的患者更多（P=0.003）（圖5E、F）吏饿。在兩組的GSEA分析中踪危，與細(xì)胞周期和遷移相關(guān)的通路蔬浙，如G2M檢查點、E2F靶點和EMT贞远，似乎在高危組中更為活躍畴博，這可能是預(yù)后不良的原因（圖5G）。結(jié)果表明蓝仲，靜息肥大細(xì)胞俱病、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和TregT細(xì)胞在低風(fēng)險組中高度浸潤袱结，與較高的存活概率有關(guān)亮隙。另一方面，M1和M2巨噬細(xì)胞的高度聚集垢夹、APC協(xié)同抑制和APC協(xié)同刺激與較低的存活概率相關(guān)咱揍。

LDFM、HDFM和MDFM的潛在調(diào)控機制

為了研究FDGs在MESO發(fā)病過程中的可能功能和分子機制棚饵，作者創(chuàng)建了整合的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)煤裙，確定了在各MESO亞型中與標(biāo)志性FDGs相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（TFs）、通路噪漾、免疫細(xì)胞硼砰、免疫成分和RPPA（圖6A）。熱圖用于描述調(diào)控網(wǎng)絡(luò)元素之間的相關(guān)性（圖6B）欣硼。

MESO亞型1：低分化成纖維細(xì)胞相關(guān)間皮瘤（LDFM）：SERPINE1和INHBA這兩個與分化狀態(tài)1相關(guān)的風(fēng)險基因（圖4A）出現(xiàn)在LDFM的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中（圖6A）题翰，與多個信號通路呈正相關(guān)，包括頂端連接诈胜、EMT豹障、IL2_STAT5信號傳導(dǎo)、TGF_beta信號傳導(dǎo)和通過NFκB的TNFA_信號傳導(dǎo)焦匈。ATAC-seq分析顯示SEPINE1和INHBA附近的染色體可及性增加血公，這表明TF或其他調(diào)控元件可能與這些區(qū)域結(jié)合（圖6C）。

MESO亞型2：高分化成纖維細(xì)胞相關(guān)間皮瘤（HDFM）：在HDFM的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中（圖6A）缓熟，UBC2E和CDC20與E2F靶點和G2M檢查點呈正相關(guān)累魔，這與HDFM富集于細(xì)胞周期通路的通路富集結(jié)果一致，暗示了其高度增殖能力够滑。網(wǎng)絡(luò)中的另一種FDGCOL4A2與EMT和TGF_beta信號傳導(dǎo)有關(guān)垦写。此外，這三個基因附近區(qū)域的染色體可及性也有所增加（圖6C）彰触，這可能與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的三個TF（NCAPG梯投、MYBL2和NOTCH1）有關(guān)。

MESO亞型3：中度分化的成纖維細(xì)胞相關(guān)間皮瘤（MDFM）：與在LDFM和HDFM相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)的基因不同，MDFM調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的HP和CFB都被認(rèn)為是生存的有利因素分蓖，并與分化狀態(tài)3相關(guān)（圖4A和5B）吮龄。它們與EMT、hedgehog和TGF_beta信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路的負(fù)向聯(lián)系也證實了它們的有利作用咆疗。實際上漓帚，如圖4D所示，這兩種FDGs在HDFM中的表達(dá)高于MDFM午磁，這也是HDFM在三個亞型中預(yù)后最好的部分原因尝抖。

抑制劑預(yù)測

為了增加藥物選擇以改善預(yù)后不良的MESO患者的生存率，作者利用pRRophetic包估算了三種亞型對各種抑制劑的敏感性迅皇。最終篩選出24種抑制劑昧辽，其中LDFM比HDFM更敏感（圖6D）。

臨床標(biāo)本驗證

為進一步驗證MESO患者臨床亞型分為LDFM登颓、HDFM和MDFM搅荞，臨床標(biāo)本被納入濕實驗驗證。圖7A是五種不同標(biāo)記物INHBA（LDFM）框咙、UBE2C（HDFM）咕痛、CDC20（HDFM）、HP（MDFM）和CFB（MDFM）在光鏡視野下的免疫組化染色切片喇嘱。

隨后進行了皮爾遜卡方檢驗茉贡，結(jié)果顯示LDFM、HDFM和MDFM亞型在分化（圖7B）者铜、免疫浸潤（圖7C）和轉(zhuǎn)移（圖7D）方面存在顯著差異腔丧。由此可以推斷，HDFM表明MESO分化好作烟、免疫浸潤高且無轉(zhuǎn)移愉粤，而LDFM表明MESO分化差、免疫浸潤低且有轉(zhuǎn)移拿撩，MDFM處于中間位置衣厘，這對MESO患者的臨床分類提供了很好的驗證。

研究總結(jié)：

通過整合scRNA測序bulk RNA測序數(shù)據(jù)绷雏，作者共鑒定出六種成纖維細(xì)胞亞型头滔、三種分化狀態(tài)和39種FDGs。根據(jù)FDGs的表達(dá)水平涎显，在基于成纖維細(xì)胞分化的分類（FDBC）中構(gòu)建了獨立于臨床參數(shù)的MESO創(chuàng)新分類和預(yù)后預(yù)測模型，該模型具有良好的預(yù)后性能兴猩，有助于精確診斷和預(yù)后判斷期吓。在多變量預(yù)后預(yù)測模型中，依賴于幾種重要FDGs表達(dá)水平的風(fēng)險評分被證實是一個獨立有效的預(yù)后因素。最后讨勤，作者預(yù)測了24種治療MESO的潛在藥物箭跳。此外，免疫組化染色和統(tǒng)計分析也提供了進一步的驗證潭千。