在我國陕壹，乳腺癌發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，是嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤树埠。巨噬細(xì)胞是乳腺癌微環(huán)境的主要細(xì)胞類型糠馆。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通常具有促癌和免疫抑制功能，與不良預(yù)后相關(guān)怎憋，但也有報(bào)道表明同一腫瘤內(nèi)可能同時存在具有促癌和抗癌功能的不同巨噬細(xì)胞亞群又碌。因此，本文研究者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性特征绊袋，并發(fā)現(xiàn)一種新的抗癌巨噬細(xì)胞亞群毕匀，為靶向巨噬細(xì)胞的癌癥治療提供了新的思路。
文章詳情
文章題目：Tissue-resident FOLR2+?macrophages associate with CD8+T cell infiltration in human breast cancer
中文題目：組織駐留型FOLR2+巨噬細(xì)胞與人乳腺癌中CD8+?T細(xì)胞浸潤有關(guān)
發(fā)表時間：2022年3月
期刊名稱：Cell
影響因子：41.582
實(shí)驗(yàn)平臺：流式細(xì)胞分選技術(shù)癌别、10x Chromium單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序皂岔、IHC、激光共聚焦顯微成像技術(shù)等
DOI：10.1016/j.cell.2022.02.021
研究思路
研究內(nèi)容
1展姐、APOE表達(dá)鑒定乳腺癌中的TAMs
? ? ? ?研究者使用一個未接受過治療的管腔型乳腺癌（BC）患者隊(duì)列樣品躁垛，分析了匹配的原發(fā)腫瘤中非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)（LN）內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞數(shù)量，并發(fā)現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移LNs中CD1c-CD14+單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量較非轉(zhuǎn)移LNs顯著增加（圖1A）圾笨，CD14+細(xì)胞浸潤與LNs腫瘤侵襲程度有關(guān)（圖1B）教馆。接下來，研究者從癌轉(zhuǎn)移LNs擂达、原發(fā)腫瘤和血液中分離出單核巨噬細(xì)胞并進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（圖1C）土铺，得到了約18000個髓系細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞注釋（圖1D和E）。此外，APOE同源表達(dá)選擇性地將TAM與CD14+單核細(xì)胞和CD1c+DCs區(qū)分出來（圖1F）舒憾。從蛋白表達(dá)水平上镀钓，利用染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)APOE和CCR2可以將巨噬細(xì)胞/TAMs與CD1c-CD14+細(xì)胞內(nèi)的單核細(xì)胞區(qū)分開，隨著腫瘤負(fù)荷增加镀迂，CD14+細(xì)胞內(nèi)APOE+巨噬細(xì)胞比例也隨之增加丁溅，而CCR2+單核細(xì)胞比例降低（圖1G）。綜上所述探遵，研究者找到了APOE窟赏，作為鑒定管腔型BC原發(fā)腫瘤和癌轉(zhuǎn)移LNs中巨噬細(xì)胞的特異標(biāo)志物。
2箱季、單細(xì)胞RNA測序揭示了兩種APOE+巨噬細(xì)胞亞群
? ? ? ?通過對找到的APOE+TAMs進(jìn)行亞亞群分析涯穷，得到了三個亞亞群，系統(tǒng)聚類分析發(fā)現(xiàn)三個亞亞群中0和1在轉(zhuǎn)錄上關(guān)系更近（圖2A和B）藏雏。利用SCENIC進(jìn)一步探究巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性發(fā)現(xiàn)0和1有約一半的共同調(diào)控子拷况，而2則有一些獨(dú)特的調(diào)控子（圖2C）【蚺梗基因表達(dá)差異分析表明赚瘦，FOLR2、SEPP1奏寨、SLC40A1起意、MRC1和LYVE1在2中高表達(dá)，而TREM2病瞳、SPP1揽咕、ISG15則在0和1中高表達(dá)（圖2D）。其中套菜，FOLR2是2的定義marker亲善，TREM2是0和1的定義marker《翰瘢總之逗爹，APOE+巨噬細(xì)胞中包含2種細(xì)胞類型：TREM2+或FOLR2+巨噬細(xì)胞（圖2E）。然而嚎于，在TAMs的細(xì)胞表面未能檢測到TREM2蛋白的表達(dá)，不過在亞亞群1（Trem2high巨噬細(xì)胞）中發(fā)現(xiàn)CADM1的特異性表達(dá)挟冠，其染色也呈陽性（圖2F和G）于购。從原發(fā)癌和癌轉(zhuǎn)移LNs中分選出FOLR2+CADM1-和FOLR2lowCADM1+巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)前者呈典型的巨噬細(xì)胞形態(tài)并充滿空泡知染，而后者體積更小肋僧，形態(tài)更接近單核細(xì)胞（圖2G）。對FORL2+CADM1-巨噬細(xì)胞、FOLR2lowCADM1+巨噬細(xì)胞和CD14+CCR2+單核細(xì)胞進(jìn)行bulk RNA測序嫌吠，發(fā)現(xiàn)FOLR2+巨噬細(xì)胞與另外兩種細(xì)胞距離較遠(yuǎn)止潘，且高表達(dá)FOLR2、SEPP1辫诅、SLC40A1和LYVE1（圖2H-J）凭戴。這些結(jié)果表明，乳腺TAMs由兩種細(xì)胞群組成炕矮，它們可以通過TREM2/CADM1和FOLR2的互斥表達(dá)區(qū)分么夫。
3、FOLR2+巨噬細(xì)胞是組織駐留性巨噬細(xì)胞
? ? ? ?研究者結(jié)合近期研究結(jié)果和自己的發(fā)現(xiàn)肤视，認(rèn)為TREM2+CADM1+巨噬細(xì)胞來源于腫瘤發(fā)展過程中循環(huán)單核細(xì)胞的浸潤档痪，而FOLR2+巨噬細(xì)胞的起源尚不清楚。為了解決這個問題邢滑，研究者利用質(zhì)譜流式技術(shù)對健康組織和乳腺腫瘤病變組織中的FOLR2+巨噬細(xì)胞進(jìn)行了定量腐螟，發(fā)現(xiàn)在APOE+巨噬細(xì)胞中，F(xiàn)OLR2+巨噬細(xì)胞富集在正常組織和癌旁中困后，并隨著腫瘤發(fā)展乐纸，其比例被FOLR2-巨噬細(xì)胞稀釋（包括TREM2+巨噬細(xì)胞）（圖3A），但由于正常組織和腫瘤中FOLR2+巨噬細(xì)胞在總活細(xì)胞比例中保持穩(wěn)定操灿，說明在腫瘤病變中锯仪，F(xiàn)OLR2+巨噬細(xì)胞群體并沒有減少。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中不同亞型的BC樣本的分析趾盐，也在轉(zhuǎn)錄水平上證實(shí)了FOLR2+巨噬細(xì)胞在鄰近正常組織比腫瘤病變組織富集程度更高庶喜，IHC分析顯示FOLR2+巨噬細(xì)胞在BC各亞型中均有表達(dá)（圖3B和C）。此外救鲤，前面的研究中發(fā)現(xiàn)FOLR2+巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)LYVE1和MRC1/CD206久窟，這些都是血管周圍（PV）巨噬細(xì)胞的marker，共聚焦成像顯示FOLR2+CD206+巨噬細(xì)胞確實(shí)位于腫瘤和鄰近組織中CD31+血管附近（圖3D）本缠。綜上所述斥扛，FOLR2+巨噬細(xì)胞是與健康乳腺（MG）相關(guān)的PV組織駐留巨噬細(xì)胞（TRM）。
? ? ? ?接下來丹锹，研究者利用小鼠模型進(jìn)行單細(xì)胞測序來分析巨噬細(xì)胞稀颁，共鑒定到3個巨噬細(xì)胞亞群，其中兩個表達(dá)Cadm1(0和1兩個亞群)（圖3E）楣黍，第三個離散亞群（2號亞群）為Folr2+Mrc1+巨噬細(xì)胞匾灶，人和小鼠的FOLR2+巨噬細(xì)胞共同表達(dá)FOLR2、MRC1租漂、LYVE1和MAF（圖3F）阶女。為了探索人和小鼠FOLR2+巨噬細(xì)胞之間的相似性颊糜，研究者在單個細(xì)胞水平進(jìn)行同源基因的相似性分析，證實(shí)了小鼠Folr2+巨噬細(xì)胞和人FOLR2+巨噬細(xì)胞的一致秃踩，說明FOLR2+巨噬細(xì)胞在小鼠和人管腔型乳腺癌之間是保守的（圖3G）衬鱼。在健康（WT）、病變前憔杨、腫瘤性病變鸟赫、早期癌和晚期癌小鼠中分析FOLR2+和CADM1+巨噬細(xì)胞動態(tài)變化。其中芍秆，F(xiàn)OLR2+巨噬細(xì)胞約占健康MG巨噬細(xì)胞總數(shù)的80%惯疙，并隨著腫瘤進(jìn)展而逐漸減少，在晚期癌中達(dá)到最低值（圖3H）妖啥。根據(jù)上述結(jié)果霉颠，研究者得出結(jié)論FOLR2+巨噬細(xì)胞是一種在晚期癌癥中持續(xù)存在且進(jìn)化上保守的TRM亞群。
4荆虱、FOLR2+巨噬細(xì)胞與BC患者的生存期增加相關(guān)
? ? ? ?通常認(rèn)為巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長并抑制抗腫瘤免疫蒿偎。因此，研究者接下來探求FOLR2+巨噬細(xì)胞是否同樣與BC患者較差的生存率有關(guān)怀读。本研究中發(fā)現(xiàn)的三個巨噬細(xì)胞亞群（圖2A）均表達(dá)了C1QA诉位、C1QB和C1QC，足以區(qū)分巨噬細(xì)胞和其他白細(xì)胞譜系菜枷。FOLR2苍糠、SEPP1?和?SLC40A1能將FOLR2+巨噬細(xì)胞和其他巨噬細(xì)胞與白細(xì)胞譜系區(qū)分開來（圖4A和B）。生存分析發(fā)現(xiàn)最高水平的巨噬細(xì)胞浸潤與較差的總生存期相關(guān)啤誊，但是高水平表達(dá)的FOLR2+巨噬細(xì)胞特征基因則與總生存期增加相關(guān)岳瞭，在不同亞型BC患者隊(duì)列中也能發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)（圖4C）。此外蚊锹，通過染色成像計(jì)算FOLR2+巨噬細(xì)胞密度瞳筏，發(fā)現(xiàn)其密度與患者生存期呈正相關(guān)（圖4D和E）。上述這些結(jié)果表明?FOLR2基因特征和 FOLR2+巨噬細(xì)胞豐度與BC患者的更好預(yù)后相關(guān)牡昆。
5姚炕、FOLR2+巨噬細(xì)胞存在于腫瘤基質(zhì)中，并且在空間上與癌癥中的TREM2+巨噬細(xì)胞分離
? ? ? ?除了乳腺癌丢烘，研究者繼續(xù)探究FOLR2+巨噬細(xì)胞在不同腫瘤中是否存在柱宦，為此分析了80多個腫瘤切片中FOLR2+細(xì)胞的分布，并在這些癌癥中發(fā)現(xiàn)了FOLR2+巨噬細(xì)胞播瞳，其持續(xù)存在于腫瘤基質(zhì)內(nèi)捷沸，很少浸潤腫瘤巢（圖5A）。對多種腫瘤連續(xù)切片進(jìn)行FOLR2和TREM2的染色分析狐史，發(fā)現(xiàn)TREM2+巨噬細(xì)胞在腫瘤巢附近浸潤或分布痒给，而FOLR2+巨噬細(xì)胞主要位于腫瘤基質(zhì)。某些癌癥中TREM2+巨噬細(xì)胞同時存在于腫瘤基質(zhì)和腫瘤巢骏全，而FOLR2+巨噬細(xì)胞仍位于腫瘤基質(zhì)中（圖5B）苍柏。為了測試腫瘤基質(zhì)中巨噬細(xì)胞豐度是否與臨床結(jié)果有關(guān)，分析了一個BC瘤周基質(zhì)區(qū)域基因芯片數(shù)據(jù)集結(jié)果姜贡，發(fā)現(xiàn)FOLR2特征基因集與更好的生存期密切相關(guān)试吁，低FOLR2則比較差，與TREM2相反（圖5D）楼咳。研究者得出結(jié)論FOLR2+巨噬細(xì)胞和TREM2+巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的空間分布彼此分離熄捍，它們在腫瘤基質(zhì)中的豐度與BC患者不同的臨床結(jié)果有關(guān)。
6母怜、FOLR2+巨噬細(xì)胞在CD8+T細(xì)胞浸潤的腫瘤中富集余耽，并與癌癥中的淋巴聚集體共定位
? ? ? ?利用FOLR2特征基因集或FOLR2表達(dá)來將FOLR2+巨噬細(xì)胞的豐度與腫瘤微環(huán)境中的其他免疫和基質(zhì)細(xì)胞類型相關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明FOLR2特征基因集（或FOLR2）與CD8+?T細(xì)胞苹熏、DC碟贾、B細(xì)胞和三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLSs）等已知的抗腫瘤免疫因子呈正相關(guān)（圖6A）。水平最高的FOLR2表達(dá)與多淋巴細(xì)胞譜系的協(xié)調(diào)浸潤和TLS的基因特征一致（圖6B）轨域。腫瘤中的FOLR2表達(dá)與各種免疫通路之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性袱耽。與CDAM1+TREM2+巨噬細(xì)胞相比，在bulk RNA測序數(shù)據(jù)集中干发，對FOLR2+巨噬細(xì)胞富集了趨化性和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)功能模塊通路朱巨，表明FOLR2+巨噬細(xì)胞是抗腫瘤免疫啟動的免疫環(huán)境的一部分（圖6C）。因?yàn)镃D8+?T細(xì)胞在包括BC在內(nèi)的各種癌癥類型中與更好的生存期有關(guān)枉长，因此研究者探求FOLR2+巨噬細(xì)胞是否與腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞互作冀续。通過對腫瘤切除標(biāo)本進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)CD31+血管附近的FOLR2+巨噬細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞聚集體密切相關(guān)（圖6D）搀暑。FOLR2+巨噬細(xì)胞含量高的腫瘤中CD8+T細(xì)胞密度顯著高于FOLR2+巨噬細(xì)胞含量低的腫瘤（圖6E）沥阳。這些結(jié)果說明基質(zhì)相關(guān)的FOLR2+巨噬細(xì)胞是腫瘤巢附近淋巴聚集體的結(jié)構(gòu)成分。
? ? ? ?為了進(jìn)一步研究這兩種細(xì)胞類型是否能有效的結(jié)合自点，研究者對BC病變樣品進(jìn)行共聚焦實(shí)時成像胧瓜，針對CD8、FOLR2铸磅、EPCAM來染色腫瘤病灶的CD8+T細(xì)胞筷弦、FOLR2+巨噬細(xì)胞和EPCAM+腫瘤細(xì)胞，隨后通過延時顯微鏡對細(xì)胞動力學(xué)成像术唬，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞降低了它們的速度并與FOLR2+巨噬細(xì)胞建立了長期聯(lián)系薪伏，這與FOLR2缺失的腫瘤區(qū)域中CD8+T細(xì)胞的高流動性形成了鮮明對比（圖6F）。這些結(jié)果揭示CD8+T細(xì)胞與FOLR2+巨噬細(xì)胞建立了長期的相互作用粗仓，這一行為可能促進(jìn)T細(xì)胞的激活嫁怀。與此結(jié)果一致设捐，腫瘤全轉(zhuǎn)錄組中FOLR2表達(dá)與控制T細(xì)胞毒性功能的基因呈正相關(guān)，但與T細(xì)胞功能障礙的基因無關(guān)（圖6G）塘淑÷苷校總之，腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞主動與FOLR2+巨噬細(xì)胞結(jié)合存捺，這種相互作用與CD8+T細(xì)胞的激活和患者的生存呈正相關(guān)槐沼。
7捌治、FOLR2+巨噬細(xì)胞能夠響應(yīng)腫瘤生長并獲得T細(xì)胞啟動能力
? ? ? ?為了解析FOLR2+巨噬細(xì)胞的功能特征岗钩，研究者利用bulk RNA測序技術(shù)來分析健康和中小型腫瘤小鼠乳腺中分離得到的FOLR2+巨噬細(xì)胞。主成分分析結(jié)果表明從乳腺腫瘤中分離的FOLR2+巨噬細(xì)胞以腫瘤大小依賴性方式改變其轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜（圖7A）肖油。乳腺癌和健康小鼠FOLR2+巨噬細(xì)胞中有1356個差異表達(dá)基因（DEG）兼吓，其中腫瘤的表達(dá)參與免疫系統(tǒng)正調(diào)節(jié)如B、T細(xì)胞趨化因子等构韵、黏附分子周蹭、溶酶體蛋白基因。而健康小鼠則富含調(diào)節(jié)代謝過程的基因疲恢，說明FOLR2+TRMs響應(yīng)腫瘤發(fā)展（圖7B和C）凶朗。為了測試乳腺癌FOLR2+和CADM1+巨噬細(xì)胞是促炎性（M1）還是抗炎性（M2）巨噬細(xì)胞，分析了這兩個細(xì)胞群M1或M2特征基因的表達(dá)情況显拳，發(fā)現(xiàn)這兩個細(xì)胞群均表達(dá)M1或M2的部分基因棚愤，說明腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞激活不符合體外M1/M2極化模型（圖7D）≡邮抗原特異性T細(xì)胞啟動實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FOLR2+巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的誘導(dǎo)初始T細(xì)胞激活宛畦、擴(kuò)增、多功能性和細(xì)胞毒性的能力揍移。此外次和，從健康MG中分離的FOLR2+巨噬細(xì)胞不能有效激活CD8+T細(xì)胞，而從乳腺癌中分離出來的FOLR2+巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增和分化（圖7E和F）那伐。這些結(jié)果證實(shí)了FOLR2+巨噬細(xì)胞在腫瘤發(fā)展過程中被激活踏施，并獲得了激活CD8+T細(xì)胞的能力。綜上所述罕邀，研究者提供了FOLR2+巨噬細(xì)胞不像免疫抑制細(xì)胞的證據(jù)畅形。相反，腫瘤相關(guān)的FOLR2+巨噬細(xì)胞是強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞诉探，具有觸發(fā)CD8+T細(xì)胞激活的功能日熬。
主要結(jié)論
本研究鑒定到一種在健康乳腺和乳腺癌原發(fā)腫瘤中存在的FOLR2+組織駐留巨噬細(xì)胞群。
1肾胯、FOLR2+巨噬細(xì)胞位于腫瘤基質(zhì)的血管周圍區(qū)域竖席，在那里它們與CD8+T細(xì)胞相互作用耘纱。
2、FOLR2+巨噬細(xì)胞在體外可有效激活效應(yīng)CD8+T細(xì)胞怕敬。
3揣炕、腫瘤中FOLR2+巨噬細(xì)胞的密度與患者較好的生存期呈正相關(guān)。
綜上所述东跪，研究者揭示了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亞群的特定作用，并為在基于巨噬細(xì)胞的癌癥治療研究中的亞群靶向治療干預(yù)思路鋪平了道路鹰溜。
參考文獻(xiàn)
Nalio Ramos, Rodrigo et al.“Tissue-resident FOLR2+ macrophages associate with CD8+?T cell infiltration in human breast cancer.”Cell vol. 185,7 (2022): 1189-1207.e25.
