今天是第3期細(xì)胞培養(yǎng)干貨-Hep G2，本期介紹Hep?G2細(xì)胞培養(yǎng)和基因編輯的實戰(zhàn)技巧蹂析。
Hep G2細(xì)胞是一種人源肝癌細(xì)胞系旗笔，來源于一名患有肝細(xì)胞癌的15歲白人男性的肝組織倒脓。這一細(xì)胞系具有廣泛的應(yīng)用價值罗心，可用于肝母細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌體外模型的建立、肝臟藥物代謝途徑研究以及肝炎病毒感染模型的構(gòu)建等城瞎。此外渤闷，經(jīng)過基因編輯改造的Hep G2細(xì)胞系也是肝癌發(fā)病機(jī)制、耐藥機(jī)制和癌癥治療等領(lǐng)域的重要工具脖镀。
然而飒箭，要確保Hep G2細(xì)胞的穩(wěn)定性和實驗結(jié)果的可靠性，掌握良好的細(xì)胞培養(yǎng)技巧尤為重要⊙鸦遥現(xiàn)在讓小源帶大家一起來了解如何培養(yǎng)好Hep G2細(xì)胞吧弦蹂。
首先，先了解一下Hep G2的基本信息强窖。
細(xì)胞培養(yǎng)步驟
細(xì)胞復(fù)蘇
1) 準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備好所要復(fù)蘇的細(xì)胞；預(yù)熱水浴鍋至37℃翅溺；預(yù)熱完全培養(yǎng)基
2) 超凈臺內(nèi)吸取7 mL已預(yù)熱好的完全培養(yǎng)基至15 mL離心管備用
3) 將細(xì)胞從干冰里取出脑漫，用鑷子夾住蓋子放入37℃水浴中快速晃動（注意：水不能沒過蓋子），使其在1分鐘左右完全融化
4) 用單道移液器將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至步驟2）提前準(zhǔn)備好的15ml離心管中咙崎，1100 rpm室溫離心 4 分鐘
5) 同時準(zhǔn)備一個新的T25培養(yǎng)瓶优幸，加入4mL完全培養(yǎng)基
6) 離心結(jié)束，棄去上清褪猛，加入1mL新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后加入步驟5）的培養(yǎng)瓶里网杆，放入培養(yǎng)箱
7) 第二天觀察細(xì)胞狀態(tài)及貼壁情況。
細(xì)胞傳代（以T25瓶為例）
1) 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時可進(jìn)行傳代伊滋，傳代時在超凈臺內(nèi)棄去培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液碳却，加入5mLPBS洗滌細(xì)胞1-2次
2)?[加入1mL胰酶，輕輕晃動瓶子并使胰酶完全浸過細(xì)胞新啼，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱孵育1-3分鐘追城，待在顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞變圓不貼壁，輕輕晃動培養(yǎng)瓶兩側(cè)有大部分細(xì)胞脫離時燥撞，立即終止消化
3) 加入2倍胰酶體積即2mL完全培養(yǎng)基終止消化座柱，然后轉(zhuǎn)移至15mL離心管中
4) 1100 rpm室溫離心 4 分鐘迷帜，離心結(jié)束，棄去上清色洞，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞
5) 細(xì)胞按照1:2-1:4比例傳代戏锹，傳代第二天觀察細(xì)胞狀態(tài)
注意事項：1.Hep G2細(xì)胞呈塊狀生長。細(xì)胞傳代消化一定要完全火诸，輕拍培養(yǎng)瓶至細(xì)胞團(tuán)塊完全脫落可進(jìn)行終止消化锦针，消化不完全的話，細(xì)胞容易聚集成團(tuán)
1.重懸吹打細(xì)胞時盡量把細(xì)胞吹散置蜀，吹成單細(xì)胞奈搜，但要注意吹打力度需適中溫柔，不可大力吹打盯荤，避免對細(xì)胞造成損傷
2. 細(xì)胞對培養(yǎng)條件嚴(yán)格馋吗，特別是對血清敏感，需要選擇高質(zhì)量胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)
3. 由于細(xì)胞會呈團(tuán)塊生長秋秤，復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)可能會與正常細(xì)胞形態(tài)存在差異宏粤，這是正常的，經(jīng)過幾次傳代后細(xì)胞形態(tài)會恢復(fù)正常
4. 細(xì)胞培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)少量空泡灼卢，這是正成馨ィ現(xiàn)象
細(xì)胞凍存：
1) 按細(xì)胞傳代的方法，在超凈臺內(nèi)把培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞進(jìn)行消化至單細(xì)胞懸液鞋真，所有液體轉(zhuǎn)移到離心管中
2) 用移液管吹打混合均勻崇堰，取20 μL進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)
3) 1100 rpm室溫離心4分鐘，離心結(jié)束棄去上清灿巧，用1~2 mL 4℃預(yù)冷的凍存液重懸細(xì)胞赶袄，隨后加入凍存液調(diào)整至密度為1*10^6個細(xì)胞/mL
4) 將細(xì)胞懸液按1 mL/管平均分裝至提前貼好標(biāo)簽的凍存管中
5) 將凍存管放置于4℃預(yù)冷的程序降溫盒中，并在凍存結(jié)束的15分鐘之內(nèi)將程序降溫盒放置超低溫冰箱抠藕；
6)過夜后饿肺，將凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮罐內(nèi)保存
FAQs
如何避免細(xì)胞復(fù)蘇存活率低？
1.?復(fù)蘇時要做到快且穩(wěn)
2. 復(fù)蘇后培養(yǎng)條件選擇正確盾似，選擇正確的培養(yǎng)基敬辣、血清、溫度零院、二氧化碳濃度等溉跃，避免過度振動培養(yǎng)皿，減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷
3.?復(fù)蘇時可先接種至小培養(yǎng)皿培養(yǎng)告抄，待小培養(yǎng)皿長滿后再進(jìn)行擴(kuò)增
4.?凍存前要確保細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)
5.可在凍存前消化終止離心結(jié)束后用PBS洗滌細(xì)胞兩次后再加凍存液重懸細(xì)胞
6. 可適當(dāng)提高凍存密度
細(xì)胞狀態(tài)差如何調(diào)整撰茎？
1.?培養(yǎng)基和血清：確保使用正確的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和加入適量血清；Hep G2細(xì)胞可提高血清濃度進(jìn)行培養(yǎng)
2.?細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境：確認(rèn)培養(yǎng)溫度打洼、濕度龄糊、氣相條件是否正常
3.?細(xì)胞傳代逆粹、換液操作：細(xì)胞傳代時，注意消化時間和胰酶濃度炫惩，避免因消化時間過長或過短導(dǎo)致的細(xì)胞損傷僻弹；一般2～3天進(jìn)行一次換液，避免長時間不進(jìn)行換液處理
4.細(xì)胞復(fù)蘇及凍存：確保細(xì)胞復(fù)蘇和凍存操作規(guī)范他嚷，以減少細(xì)胞損傷和死亡
5. 若細(xì)胞密度低蹋绽，可提高細(xì)胞密度至70%以上，細(xì)胞密度大筋蓖，細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子多卸耘，有利于細(xì)胞增殖。
細(xì)胞表面存在死細(xì)胞如何處理粘咖？
1. 用PBS搖晃清洗兩次鹊奖，然后加入胰酶進(jìn)行搖晃潤洗，待觀察到表面的死細(xì)胞有要飄起來的跡象時涂炎，快速棄掉胰酶
2. 再次加入PBS清洗細(xì)胞，然后加入胰酶正常消化
3. 可在消化終止離心結(jié)束后加入PBS重懸再洗細(xì)胞一次
基因編輯小Tips
Hep G2細(xì)胞如何提高轉(zhuǎn)染效率设哗？
1.確保細(xì)胞狀態(tài)良好唱捣，細(xì)胞處于對數(shù)生長期，細(xì)胞密度適中
2.注意細(xì)胞消化時間网梢，避免過度消化震缭，對細(xì)胞造成傷害
3.細(xì)胞進(jìn)行實驗時建議活率＞80%
4.實驗過程中細(xì)胞要吹打成單細(xì)胞，避免細(xì)胞聚團(tuán)
5.使用不同轉(zhuǎn)染方法战虏，要注意的細(xì)節(jié)也有所不同拣宰，小源列舉了常用的電轉(zhuǎn)法和慢病毒法。
Hep G2細(xì)胞如何提高單克隆形成率烦感？
1.細(xì)胞鋪克隆時活率需要＞80%
2.鋪克隆時選擇使用優(yōu)質(zhì)胎牛血清
3.鋪克隆可用PBS清洗1次
又是干貨滿滿的一天巡社，希望這些干貨分享能讓大家對培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞更加充滿信心！
