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01 啟動子的基本類型
啟動子是基因的重要組成部分触菜，其主要功能為調(diào)控基因表達（轉(zhuǎn)錄）的起始時間和表達程度灸芳。但啟動子本身并不控制基因活動瘟栖，而是通過與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來控制基因活動。根據(jù)啟動子對轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控程度艇抠，將其分為弱啟動子和強啟動子；此外，參照轉(zhuǎn)錄模式豺瘤，其又可被分為：
（1）組成型啟動子（Constitutive promoter），能夠調(diào)控基因表達听诸，使其基本恒定在一定程度上坐求，從而使基因在不同部位或組織中的表達水平不存在明顯差異；
（2）組織特異性啟動子（Tissue specific promoter）晌梨，其調(diào)控作用使得基因往往只在某些特定器官或組織中表達桥嗤，且表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性；
（3）誘導型啟動子（Inducible promoter）仔蝌，即在某些特定的物理或化學信號刺激后泛领，基因轉(zhuǎn)錄水平在該類啟動子的調(diào)控下大幅度地提升。
02 啟動子的特點
（1）通常含一些特定的元件掌逛，如TATA box师逸；
（2）具有方向性，調(diào)控啟動下游的基因表達；
（3）長度的不確定性篓像，一般認為ATG上游2500bp的序列是該基因的啟動子序列动知；
（4）一個基因通常含有多個啟動子，啟動不同轉(zhuǎn)錄本的表達员辩；
（5）某些啟動子具有表達的時空性和組織特異性盒粮。
03 啟動子的研究思路
啟動子功能及結(jié)構(gòu)的研究，可以從以下幾個方面著手：
（1）啟動子結(jié)構(gòu)研究奠滑，包括核心啟動子區(qū)域丹皱、正調(diào)控區(qū)域、負調(diào)控區(qū)域以及增強子的確定宋税；
（2）組織特異性啟動子篩選及確定摊崭；
（3）轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件相互作用研究；
（4）啟動子甲基化作用研究杰赛；
（5）新順式作用元件發(fā)現(xiàn)及功能鑒定呢簸。
04 研究路線
05 啟動子研究的相關(guān)技術(shù)方法
5.1 啟動子克隆
啟動子克隆，一般分為兩種類型：一種是已知啟動子序列乏屯，可以直接采用基因克隆的方法進行實驗根时；另一種是未知啟動子序列，只知道轉(zhuǎn)錄組或部分編碼序列辰晕，這個時候就可以采用特殊的的擴增方法——染色體步移進行未知序列的擴增蛤迎。
染色體步移（Genome Walking）可以克隆已知序列的側(cè)翼未知序列，基于PCR技術(shù)的染色體步移技術(shù)先后有十幾種方法含友，目前最常使用的是TAIL-PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR）替裆，即交錯式熱不對稱PCR技術(shù)。利用特異性套嵌引物唱较，結(jié)合簡并引物釣取側(cè)翼序列扎唾，其基本原理是利用目標序列附近的已知序列設(shè)計3個嵌套的特異引物（SP1召川，SP2南缓，SP3），用它們分別和1個具有低Tm值的短的隨機簡并引物（AD）相結(jié)合荧呐，根據(jù)引物的長短和特異性的差異設(shè)計不對稱的溫度循環(huán)汉形，通過分級反應來擴增特異產(chǎn)物。
（研究啟動子可以帶上5'UTR倍阐，第一個外顯子不要帶）
5.2 啟動子活性分析
啟動子的表達模式及強度只能通過報告基因來檢測概疆，目前在植物啟動子的研究中常用的報告基因有β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、綠色熒光蛋白基因（GFP）及其衍生出來的其他熒光蛋白峰搪、熒光素酶基因（LUC）等岔冀，其中最常用的是GUS報告基因。使用“啟動子-報告基因-終止子”的載體構(gòu)建方式概耻，該方式適用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)使套、基因槍轟擊或農(nóng)桿菌介導的瞬時表達系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)基因植物的穩(wěn)定表達系統(tǒng)等罐呼。將啟動子與GUS報告基因相連進行轉(zhuǎn)化，根據(jù)植物組織染色的結(jié)果可判斷啟動子表達的時空性和表達強度侦高。
5.3 啟動子核心元件分析
對于啟動子嫉柴，我們可以通過5’非翻譯區(qū)一系列的缺失突變，構(gòu)建啟動子分析載體（如pCAMBIA1391奉呛，pBWA（v）H-gus載體）计螺，不斷縮小范圍，找到某一段對于該基因的啟動子活性是必須的或者是最重要的序列瞧壮。當找到這個比較核心的啟動子序列后登馒，可以通過一些在線的軟件去預測其順式作用元件的位點，每個在線軟件都有自己獨特的算法分析咆槽，得到的結(jié)果并不都是可靠的谊娇，每個軟件都有自己的優(yōu)勢，需要多綜合一些軟件預測的結(jié)果罗晕，并通過分析預測出來的轉(zhuǎn)錄因子是不是和該基因有功能上的聯(lián)系等做進一步的選擇济欢，繼續(xù)做下面的驗證實驗。常見的啟動子預測軟件有：
（1）Promoter 2.0 Prediction Server小渊，http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/
（2）Softberry預測TSSW法褥、TSSP、TSSG酬屉、FPROM都是Softberry提供的啟動子預測工具半等，http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter
（3）Plant CARE，http://bioinformatics.psb.ugent.be
5.4 基因編輯技術(shù)
基因編輯技術(shù)主要是利用序列特異性核酸酶在特定基因位點產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂呐萨，借助編輯受體自身的DNA修復系統(tǒng)在非同源末端連接（Non-homologous end joining, NHEJ）過程中產(chǎn)生隨機的Indels（Small insertions and deletions）或在同源重組修復過程中插入或替換相應的基因片段杀饵，最終實現(xiàn)基因組序列的突變。
植物的啟動子功能分析中谬擦，可以基于基因編輯技術(shù)切距，對啟動子核心區(qū)域進行大片段刪除，使啟動子功能缺失惨远，更好的研究啟動子的核心功能谜悟。另外，還可以借助點編輯進行關(guān)鍵性元件的點突變北秽，研究啟動子元件的重要意義葡幸。
5.5 EMSA
凝膠遷移實驗（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一種檢測蛋白質(zhì)和DNA序列相互結(jié)合的技術(shù)，可用于定性和定量分析贺氓，是轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法蔚叨。反式作用因子一般指的就是轉(zhuǎn)錄因子，順式作用元件一般是指轉(zhuǎn)錄因子和啟動子結(jié)合的那部分序列，一般是10-20bp左右蔑水。點突變證實該順式作用元件對于啟動子活性是有影響的悄泥，接下來就要用EMSA實驗驗證反式作用因子和該順式作用元件在體外是有直接結(jié)合的，反式作用因子可以用細胞核抽提物做肤粱，也可以用體外表達純化的蛋白做或該反式作用因子的抗體做Super shift實驗弹囚，利用這些實驗可以證實順式作用元件與反式作用因子的特異性結(jié)合。
5.6 ChIP實驗
EMSA的實驗結(jié)果并不能說明反式作用因子和順式作用元件有結(jié)合领曼，畢竟體外的結(jié)合并不能代表生理條件下的結(jié)合鸥鹉。接下來就要用染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）技術(shù)來驗證順式作用元件和反式作用因子是否有結(jié)合庶骄。
ChIP是在生理條件下將細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)與DNA進行交聯(lián)并在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復合物毁渗，在超聲波作用下將其隨機切斷成一定長度的染色質(zhì)片段，然后沉淀該復合物单刁，特異性富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段灸异，經(jīng)過DNA純化以及其鑒定，從而獲得蛋白質(zhì)和DNA相互作用的信息羔飞。
5.7 DNase I足跡法
DNase I足跡法是一種確定DNA結(jié)合蛋白在DNA分子上的結(jié)合位點的方法肺樟。
足跡試驗的方法較多，常用的有DNase I足跡試驗和硫酸二甲酯足跡試驗(dimethylsulfate逻淌，DMS)么伯，兩者原理基本相同。
蛋白質(zhì)結(jié)合在DNA片段上卡儒，能保護結(jié)合部位不被DNase破壞箭券，DNA分子經(jīng)酶切作用后遺留下該片段(亦稱“足跡”)邪意，進而可以確定它的序列力崇。在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上爸黄，相應于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位沒有放射性標記條帶。
? ? DNase I足跡試驗的實驗流程如下：①待檢雙鏈DNA分子用32 P作末端標記擎鸠，通常只標記一端缀磕；②蛋白質(zhì)與DNA混合，等兩者結(jié)合后糠亩，加入適量的DNase I虐骑，消化DNA分子准验，控制酶的用量赎线，使之達到每個DNA分子只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂，并列設(shè)置未加蛋白質(zhì)的對照糊饱；③從DNA上除去蛋白質(zhì)垂寥，將變性的DNA加樣在測序凝膠中作電泳和放射性自顯影，與對照組相比后解讀出足跡部位的核苷酸序列。（對DNA蛋白質(zhì)復合物進行酶切會形成不同長度的DNA片段滞项，最好保證相鄰的DNA片段只相差一個核苷酸狭归，片段經(jīng)變性后用PAGE電泳分離，放射自顯影文判，便可形成只有一個核苷酸差異的DNA梯形帶过椎。DNase I由于空間位阻不能直接綁定相鄰的DNA結(jié)合蛋白，因此戏仓，足跡特征比較明顯疚宇，一般比自身位點大8~10bp個堿基對。）
? ? 足跡試驗特異性好赏殃，定位精確敷待，使用廣泛。
5.8 雙熒光報告系統(tǒng)
利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學發(fā)光反應的特性仁热，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游榜揖，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染細胞抗蠢，經(jīng)適當刺激或處理后裂解細胞举哟，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響迅矛。雙熒光報告系統(tǒng)在啟動子分析中有如下應用：
（1）啟動子結(jié)構(gòu)分析：將待測啟動子區(qū)域序列進行分段截短炎滞，或?qū)μ囟ㄎ稽c進行突變，再分別插入LUC/GUS報告基因上游诬乞，檢測其啟動子的活性册赛。
（2）啟動子SNP分析：一些基因的啟動子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性，將待測啟動子插入FLuc報告基因上游震嫉，檢測螢光素酶活性森瘪，從而判斷這些啟動子的相對活性。
（3）轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的互作分析：將該啟動子序列插入LUC報告基因上游票堵，同時在細胞中共轉(zhuǎn)表達轉(zhuǎn)錄因子扼睬，分析轉(zhuǎn)錄因子是否調(diào)控螢光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的調(diào)控作用悴势。
5.9 啟動子區(qū)域甲基化
DNA甲基化是一個生物過程窗宇，可在DNA分子中引入甲基化基團，其不會改變DNA序列本身特纤，而只是改變DNA片段的活性军俊。據(jù)報道，在幾乎所有已分析過的生物中捧存，啟動子區(qū)域的甲基化水平均與基因表達負相關(guān)粪躬，且具有轉(zhuǎn)錄活性基因的CpG密集啟動子從未被甲基化担败，但是，轉(zhuǎn)錄沉默基因并不一定帶有甲基化的啟動子镰官。值得注意的是提前，盡管CpG島的DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制作用明確相關(guān)，但對CG缺乏的啟動子中DNA甲基化的功能仍不清楚泳唠。研究顯示狈网，DNA甲基化可能以兩種方式影響基因轉(zhuǎn)錄：其一為DNA本身的甲基化可能在物理上阻礙轉(zhuǎn)錄因子與基因的結(jié)合；其二為甲基化的DNA可能被稱為甲基CpG結(jié)合域（methyl-CpG-binding domain笨腥，MBD）的蛋白結(jié)合孙援，促使MBD蛋白將其他蛋白募集到位點，例如組蛋白脫乙跎鹊瘢基酶和其他可以修飾組蛋白的染色質(zhì)重塑因子拓售，從而形成致密的、無活性的異染色質(zhì)镶奉。
5.10 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)
植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指把從動物础淤、植物、微生物中分離到的目的基因或者人工設(shè)計合成的核酸片段哨苛，通過多種方法轉(zhuǎn)移到植物的基因組中鸽凶，使之穩(wěn)定遺傳。植物啟動子研究過程中往往需要進行穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化建峭，實驗中需要將構(gòu)建的啟動子分析載體玻侥，借助于農(nóng)桿菌或者基因槍，穩(wěn)定轉(zhuǎn)入植物之中亿蒸，獲得轉(zhuǎn)基因苗凑兰，然后對其進行進一步的實驗分析，（PS：我司目前可提供的常規(guī)轉(zhuǎn)化物種有：水稻边锁、煙草姑食、油菜、番茄茅坛、擬南芥音半、棉花、大豆贡蓖、玉米曹鸠、楊樹、馬鈴薯斥铺、苜蓿和黃瓜等）彻桃。
REFERENCES
Qin BX, Tang D, Huang J, et al. Rice OsGL1-1 is involved in leaf cuticular wax and cuticle membrane. Mol Plant, 2011, 4(6): 985-95.
Song C, Zhang S, Huang H. Choosing a suitable method for the identification of replication origins in microbial genomes. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.
（啟動子可以被RNA聚合酶辨認，并開始轉(zhuǎn)錄合成RNA仅父。在RNA合成中叛薯，啟動子可以和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生相互作用浑吟，控制基因表達（轉(zhuǎn)錄）的起始時間和表達的程度笙纤，意思就是說沒有轉(zhuǎn)錄因子啟動子也是可以轉(zhuǎn)錄的耗溜，轉(zhuǎn)錄因子的存在可以調(diào)控這種轉(zhuǎn)錄。)
