在過去約 2 年中開發(fā)了幾種方法，可以同時(shí)測量單細(xì)胞中的 DNA 可及性和基因表達(dá)雹顺。對我來說斑匪，這些聯(lián)合檢測方法是單細(xì)胞生物學(xué)中最令人興奮的前沿之一龟虎，并將開辟一系列研究基因調(diào)控的新方法。

這些新的單細(xì)胞共檢測方法包括 sciCAR匠璧、scCAT-seq桐款、SNARE-seq、Paired-seq夷恍、ASTAR-seq魔眨、SHARE-seq，以及 10x Genomics 最近發(fā)布的商業(yè)解決方案酿雪。在這篇文章中遏暴，我將概述每種方法，解釋它們的工作原理指黎，并對每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)發(fā)表一些評論朋凉。在查看這些方法時(shí)需要考慮的一些重要事項(xiàng)是靈敏度和細(xì)胞通量、有多少百分比的細(xì)胞獲得了兩種測定的可用測量值醋安、實(shí)驗(yàn)工作流程的復(fù)雜性/難度以及它們是否使用細(xì)胞或細(xì)胞核作為輸入杂彭。請記住，我自己沒有運(yùn)行任何這些協(xié)議吓揪，這里介紹的所有內(nèi)容僅來自閱讀論文亲怠，并且在某些情況下探索公開可用的數(shù)據(jù)集。

sci-CAR

https://www.science.org/doi/10.1126/science.aau0730
sci-CAR 方法是第一個(gè)發(fā)表的單細(xì)胞基因表達(dá) DNA 可及性共測定方法(Cao et al. 2018)柠辞。它使用基于板的組合索引策略团秽，基本上結(jié)合了 sciRNA-seq 和 sciATAC-seq。基本工作流程如下：

1. 提取細(xì)胞核（固定或不固定）
2. 分配到井中
3. 使用具有良好特異性條形碼和 UMI 的 oligo-dT RT 引物通過原位逆轉(zhuǎn)錄（核內(nèi) RT）添加 RNA-seq 索引
4. 通過帶有條形碼的 Tn5 適配器（非常具體）的原位標(biāo)記添加第一個(gè) ATAC-seq 索引徙垫。在此階段不要添加 SDS讥裤，因此 DNA 與 Tn5 集成保持完整。
5. FANS 匯集和重新分配原子核
6. 對 cDNA 進(jìn)行第二鏈合成
7. 裂解核
8. 分成 ATAC 和 cDNA 部分
9. 通過轉(zhuǎn)座與未索引的 Tn5 對 cDNA 進(jìn)行片段化
10. 使用未條形碼 Tn5 適配器手柄和 RT 引物特有的引物放大 cDNA 3' 標(biāo)簽姻报。這包含了第二個(gè)特定于井的索引并提供了 RNA 庫己英。
11. 使用特定于條形碼 Tn5 適配器的引物放大 ATAC 裂解物。這還添加了第二個(gè)特定于井的條形碼吴旋。這給出了 ATAC-seq 庫损肛。

關(guān)于此協(xié)議，有幾點(diǎn)需要注意荣瑟。首先治拿，我預(yù)計(jì)第一個(gè) Tn5 轉(zhuǎn)座也會導(dǎo)致一些整合事件到原位 PCR 產(chǎn)生的 RNA/DNA 異源雙鏈中，因?yàn)?Tn5 可以整合到 RNA/DNA 異源雙鏈中（Di et al. 2020）. 這會降低 RNA 檢測的靈敏度笆焰，因?yàn)樗鼤蓴_第二鏈合成劫谅，并可能導(dǎo)致一些 cDNA 分子進(jìn)入 ATAC 文庫并被誤認(rèn)為是開放的染色質(zhì)區(qū)域。公平地說嚷掠，我認(rèn)為 2018 年 Tn5 可以整合到異源雙鏈中并不廣為人知捏检。更好的策略可能是先進(jìn)行標(biāo)記，然后進(jìn)行原位 RT不皆。sciCAR 的 ATAC 檢測靈敏度比標(biāo)準(zhǔn) scATAC-seq 低約 10 倍贯城。大多數(shù)細(xì)胞 (88-93%) 都有 RNA 和 ATAC 的測量值。

作者使用他們的共同分析數(shù)據(jù)集進(jìn)行了一些有趣的分析霹娄，如果可以改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法能犯，他們確實(shí)能夠突出這些類型的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集的潛在效用。他們發(fā)現(xiàn)啟動子可及性和基因表達(dá)之間的相關(guān)性較弱犬耻，盡管這很可能受到兩種測量的低靈敏度的重大影響踩晶。許多基于 ATAC 的分析是使用精細(xì)聚類的“偽單元”執(zhí)行的，以幫助減少數(shù)據(jù)稀疏性香追。使用 RNA 和 ATAC 測量合瓢，他們能夠?qū)⒎迮c使用 LASSO 正則化回歸可能調(diào)節(jié)的基因聯(lián)系起來。

scCAT-seq

scCAT-seq 是一種基于低通量平板的雙基因表達(dá) DNA 可及性分析方法(Liu et al. 2019)透典。工作流程如下：

1. 使用 FACS 將單個(gè)細(xì)胞分配到板中的孔中
2. 使用溫和裂解條件（10 mM NaCl晴楔、10 mM Tris-HCl、pH 7.5峭咒、0.2% IGEPAL CA-630）裂解細(xì)胞税弃。IGEPAL 是一種非離子洗滌劑，與 Triton X-100 非常相似凑队。
3. 渦旋和離心機(jī)则果。目標(biāo)是裂解細(xì)胞膜而不是細(xì)胞核幔翰。
4. 提取上清液并轉(zhuǎn)移到不同的板（mRNA 和細(xì)胞核的物理分離）。
5. 在 RNA 分?jǐn)?shù)上運(yùn)行 Smart-seq2 協(xié)議西壮。
6. 在細(xì)胞核上運(yùn)行 ATAC-seq（轉(zhuǎn)座后添加的載體 DNA）遗增。

盡管該方法的通量非常低，但就每個(gè)細(xì)胞檢測到的基因和 DNA 片段的數(shù)量而言款青，數(shù)據(jù)質(zhì)量似乎非常好做修。然而，使用 Smart-seq2 協(xié)議意味著沒有用于基因表達(dá)測定的 UMI抡草。您可以在此處運(yùn)行任何基于板的 scRNA-seq 方法饰及，因此更新到 Smart-seq3 協(xié)議（包括 5' UMI）不會成為問題（Hagemann-Jensen et al. 2020）。對于難以獲得的小組織樣本康震，例如人類胚胎（使用論文）燎含，這可能是一個(gè)好方法。

SNARE-seq

https://www.nature.com/articles/s41587-019-0290-0

SNARE-seq 是第一個(gè)基于液滴的 RNA/ATAC 聯(lián)合檢測方法腿短，它使用一些巧妙的技巧使用標(biāo)準(zhǔn) Drop-seq 珠子收集 DNA 和 RNA 信息（Chen屏箍、Lake 和 Zhang 2019）。與 sciCAR 和 scCAT-seq 相比的一個(gè)優(yōu)勢是它不需要通過 FANS 進(jìn)行任何細(xì)胞分類答姥。它使用以下工作流程：

1. 從細(xì)胞中提取細(xì)胞核
2. 批量標(biāo)記核
3. 使用 Drop-seq 儀器將細(xì)胞核封裝在液滴中铣除。一個(gè)特殊的夾板寡核苷酸被添加到跨越 Tn5 適配器序列突出和 Drop-seq 珠子上的寡核苷酸-dT 捕獲序列的緩沖區(qū)中。
4. 將珠子加熱到 72oC 以釋放 Tn5 并釋放標(biāo)記的 DNA
5. 多腺苷酸化 mRNA 與珠結(jié)合的 RT 引物退火
6. 片段化的 gDNA 通過夾板寡核苷酸間接退火到珠結(jié)合的 RT 引物上鹦付，夾板寡核苷酸能夠與 Tn5 接頭突出序列和寡核苷酸-dT RT 引物序列退火
7. 打破乳液并執(zhí)行 RT 和連接，將珠子特異性條形碼添加到 mRNA 和 gDNA 片段中择卦。
8. 執(zhí)行 PCR 以從磁珠中擴(kuò)增 cDNA 和 gDNA 文庫
9. 拆分為 cDNA 和 gDNA 文庫

作者制作了 P0 和成年小鼠大腦的數(shù)據(jù)敲长，與早期的 sciCAR 方法相比，RNA 和 ATAC 檢測的靈敏度顯著提高秉继。P0 小鼠大腦數(shù)據(jù)集包含一些興奮性神經(jīng)元的發(fā)育軌跡祈噪，作者能夠展示一些有趣的例子，其中染色質(zhì)變化先于偽時(shí)間細(xì)胞排序中的轉(zhuǎn)錄變化尚辑。處理原始 SNARE-seq 數(shù)據(jù)的代碼可在此處獲得： https ://github.com/timoast/SNARE-seq 辑鲤。

Paired-seq

https://www.nature.com/articles/s41594-019-0323-x

與 sci-CAR 一樣，Paired-seq 是一種基于組合索引的聯(lián)合分析方法(Zhu et al. 2019)杠茬。與 sciCAR 不同月褥，它使用連接來構(gòu)建細(xì)胞條形碼（而不是 PCR），在這個(gè)意義上更類似于 SPLiT-seq (Rosenberg et al. 2018)：

1. 將原子核分配到八個(gè)管中
2. 使用條形碼 Tn5 標(biāo)記核（每個(gè)管的條形碼不同）
3. 離心并洗滌沉淀瓢喉，重懸于緩沖液中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄
4. 將條形碼 RT 引物添加到每個(gè)管中并執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄
5. 合并來自所有管的細(xì)胞核
6. 添加連接混合物并分配到板中的孔中宁赤，每個(gè)孔中都有條形碼寡核苷酸和阻斷劑
7. 孵化，然后再重復(fù)兩次合并和重新分配步驟栓票，再進(jìn)行兩輪條形碼
8. 裂解細(xì)胞核并提取 DNA
9. 使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 輔助 DNA 擴(kuò)增來擴(kuò)增 DNA决左。TdT 是一種聚合酶，可以將未模板化的核苷酸添加到 DNA 鏈中，因此可用于在 DNA 分子末端添加堿基以形成引物結(jié)合位點(diǎn)佛猛。
10. 分成兩部分用于 cDNA 和 ATAC 文庫
11. 在 cDNA 和 ATAC 文庫中添加不同的限制酶惑芭。這將專門切割源自 RT 或標(biāo)記的片段，具體取決于添加的 RE继找。

與早期方法相比遂跟，Paired-seq 大大增加了 RNA/ATAC coassay 的可擴(kuò)展性。這是由于使用了組合索引策略码荔，帶有多輪條形碼漩勤。我喜歡他們首先標(biāo)記 DNA（在 RT 之前），防止任何可能的 DNA/RNA 異源雙鏈標(biāo)記缩搅。他們也不使用任何 FANS越败，這簡化了工作流程。

然而硼瓣，由于文庫的構(gòu)建方式究飞，ATAC-seq 分析不是配對末端。讀取 1 用于讀取 gDNA 序列（標(biāo)記 DNA 的一端）或用于 RNA 測定的 cDNA堂鲤，讀取 2 用于對一系列細(xì)胞條形碼進(jìn)行測序亿傅。對于 ATAC-seq，重要的信息是 Tn5 整合位點(diǎn)瘟栖，因此僅對一個(gè) gDNA 末端進(jìn)行測序可將每個(gè)細(xì)胞測量的位點(diǎn)數(shù)量減少一半葵擎。您還會丟失片段長度信息，這對于 QC 或某些分析很有用半哟。然而酬滤，我們知道每個(gè)測序的 ATAC 片段必須來自兩個(gè)整合事件，因此能夠精確地映射這兩個(gè)事件中的一個(gè)并不完全等同于從檢測返回的信息量減半寓涨。

作者使用他們的數(shù)據(jù)集展示了一些有趣的分析盯串。特別是，他們展示了一種簡單的聯(lián)合聚類方法戒良，該方法通過從每個(gè)分析（ATAC 或 RNA）中創(chuàng)建相鄰圖并獲取相鄰圖的 Hadamard 乘積來整合來自兩種數(shù)據(jù)模式的信息体捏。Hadamard 乘積只是兩個(gè)相同維度矩陣的元素乘積，因此當(dāng)應(yīng)用于兩個(gè)圖形時(shí)糯崎，它將刪除僅存在于兩個(gè)圖形之一中的任何邊几缭。我不清楚去除一種分析所特有的邊緣是否一定是一件好事，因?yàn)樵谝环N模式中可能存在有趣的結(jié)構(gòu)拇颅，而對第二種模式的分析并不那么明顯奏司。由 Yuhan Hao 領(lǐng)導(dǎo)的 Satija 實(shí)驗(yàn)室最近的工作，（Hao 等人樟插，2020）韵洋。

與 sciCAR 工作類似竿刁，作者還使用 Pearson 相關(guān)性將峰與附近的相關(guān)基因聯(lián)系起來，并根據(jù) Jaccard 相似性將細(xì)胞“微簇”成小組搪缨，以減少數(shù)據(jù)稀疏性食拜。在這里，他們更進(jìn)一步副编，生成了 PLAC-seq 數(shù)據(jù)负甸，以驗(yàn)證他們發(fā)現(xiàn)的一些峰值基因鏈接。

ASTAR-seq

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和可及區(qū)域分析（ASTAR-seq痹届，巧合的是在新加坡的 ASTAR 開發(fā)）使用集成微流體芯片 (Fluidigm C1) 來劃分細(xì)胞呻待，類似于第一個(gè) scATAC-seq (Xing et 2020 年；布恩羅斯特羅等人 2015 年）队腐。然后在芯片內(nèi)用 Tn5 標(biāo)記細(xì)胞蚕捉，然后用生物素化的引物對 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。將生物素?fù)饺?cDNAs 允許以后用鏈霉親和素珠分離 ATAC 和 RNA 文庫柴淘。值得注意的是迫淹，作者在論文中指出，他們嘗試了一種在標(biāo)記之前執(zhí)行 RT 的方法为严，但沒有成功敛熬。他們將此歸因于 Tn5 消化單鏈 cDNA。我喜歡他們在論文中包含這些細(xì)節(jié)第股，因?yàn)?/em>沒有*工作通秤γ瘢可以像工作一樣提供信息，但通常不會在最終論文中報(bào)告夕吻。