劉小澤寫于19.6.11-文獻理解
筆記目的：根據生信技能樹的單細胞轉錄組課程探索smart-seq2技術相關的分析技術
課程鏈接在：http://jm.grazy.cn/index/mulitcourse/detail.html?cid=53
第一單元第三講：今天的內容相當于理解一篇文獻，文中全部文獻鏈接均可打開為PDF
2018年12月的NC文章：Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single cell RNA sequencing
附件在：https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1038%2Fs41467-018-07582-3/MediaObjects/41467_2018_7582_MOESM1_ESM.pdf
利用Smart-seq2探索癌癥成纖維細胞CAFs的功能和空間異質性
看一篇文章的時候楞艾，里面會有很多詞語是陌生的楣导，這時就需要去了解背景知識
研究背景
傳統的腫瘤研究是單純以腫瘤細胞為中心采桃，但是過去的幾十年中研究者對腫瘤微環(huán)境與惡性表征的聯系越來越重視。探索腫瘤細胞與微環(huán)境的相互作用為靶向治療提供了新方向耘拇。本文的目的是利用可以尋找更多基因的smart-seq2技術對小鼠乳腺癌CAFs的亞群進行鑒定翰萨，展示了時空分布情況笛谦；還探究了人類與小鼠CAFs亞型一致性碗暗，為未來靶向CAFs藥物研發(fā)或診斷標志物篩選提供基礎奖蔓。
名詞解釋
CAF（cancer-associated fibroblast）：
國際腫瘤學雜志 ：癌癥相關成纖維細胞是數量最豐富的基質細胞，在腫瘤微環(huán)境中通過細胞與細胞間相互接觸讹堤，并在各種可溶性因子的作用下，促進上皮細胞及其他細胞惡性轉化厨疙。目前發(fā)現洲守，它在許多癌癥（包括乳腺癌、胰腺癌沾凄、肝癌）的微環(huán)境中最常見梗醇。
它是具有高度的異質性的細胞群，不同的細胞亞群可能起源于不同的前體細胞撒蟀，如固有成纖維細胞叙谨、腫瘤上皮細胞、腫瘤內皮細胞保屯、骨髓來源細胞手负、其他間充質細胞等。
它在腫瘤形成中的作用：
- 重塑纖維間質中的細胞外基質
- "草船借箭"=》細胞外基質蛋白與非腫瘤細胞(如免疫細胞)的整合素受體結合姑尺，將細胞外基質蛋白募集到腫瘤細胞處竟终，發(fā)生相互作用，繼而誘導腫瘤細胞轉移侵襲
- 高密度細胞外基質導致組織間隙液壓升高切蟋，阻礙藥物傳遞與吸收
- CAFs以細胞因子和生長因子的形式分泌致瘤信號统捶，促進癌細胞生長、增殖柄粹、遷移
- CAFs分泌肝細胞生長因子（HGF）喘鸟、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)驻右，促進腫瘤對化療什黑、酪氨酸激酶抑制劑產生抗藥性
關于它的綜述：The biology and function of fibroblasts in cancer.
TME（Tumor Microenvironment）：腫瘤微環(huán)境，包括了腫瘤細胞堪夭、基質細胞(如成纖維細胞)兑凿、免疫細胞、細胞的分泌產物（如細胞因子和趨化因子）茵瘾、細胞外基質(ECM)礼华、腫瘤和非腫瘤細胞代謝產物(如過氧化氫)、特定生理環(huán)境(供養(yǎng)拗秘、ph條件圣絮、間質壓)，腫瘤在TME中就像汽車與停車場的關系雕旨。
2018年cell文章Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. 介紹了單細胞測序在研究乳腺癌微環(huán)境的應用扮匠，分析了來自8個乳腺瘤以及匹配的正常乳腺組織捧请，血液和淋巴結中的45,000個免疫細胞，做了一個乳腺癌腫瘤微環(huán)境免疫細胞圖譜棒搜。
ECM（extracellular matrix）：細胞外基質疹蛉。是由細胞合成、分泌的生物大分子在細胞表面或細胞之間構成的復雜網絡結構力麸，主要有4大類：膠原可款、非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖克蚂、彈性蛋白闺鲸。腫瘤中，細胞外基質蛋白的表達譜顯著區(qū)別于正常組織埃叭。實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程伴隨結締組織的增生與纖維化摸恍；腫瘤中細胞外基質的動態(tài)改變不僅體現在細胞外基質蛋白的表達水平與相對組成的改變，同時還表現為細胞外基質空間拓撲結構與剛性等物理學性質的改變
參考：細胞外基質與腫瘤相關成纖維細胞
EMT（ epithelial-to-mesenchymal transition）：指的是上皮型細胞在特定生理條件下向間質型細胞表型轉變赤屋。惡性腫瘤經常伴隨轉移立镶，這個過程是一個多因素、多階段的復雜過程类早。通常認為EMT會導致上皮細胞的E-cadherin谜慌、claudin、occludin等連接分子表達缺失, 破壞細胞極性莺奔；另外會促使使一些參與細胞外
基質(主要包括膠原欣范、層黏素和纖維結合素等)和基底膜降解和破壞的溶解酶如基質金屬蛋白酶高表達，破壞腫瘤細胞侵襲的組織屏障令哟。
參考：上皮–間質轉化: 腫瘤轉移的重要調控機制
MMTV-PyMT mouse model： 自發(fā)型腫瘤模型小鼠=》遺傳育種保留下來的帶有自發(fā)型乳腺癌的動物模型恼琼，與人類的發(fā)生相似，重復性公認性較好
FACS strategy：即 流式細胞分選技術屏富。不得不看看單細胞分離技術的知識晴竞，單細胞分離主要依據單細胞的表型與生物標記物，來篩選完整的單個細胞狠半，主要的分選方法有：有限稀釋法(Limiting Dilution)噩死、顯微操作(Micromanipulator)、激光顯微切割（LCM）神年、流式細胞分選（FACS）已维、微流控技術（Microfluidics）。
FACS是比較常用的方法已日，它可以獲得隨機樣品垛耳，可以利用熒光標記的抗體獲得細胞表面特異marker的細胞亞群，進而探究細胞亞群。允許將細胞分選到96或384孔板中進行后續(xù)的單細胞測序堂鲜，但是FACS需要較大的細胞量栈雳，并且會出現一孔多個或一孔沒有細胞的現象；
另外缔莲，顯微操作可以在特定位置對少量細胞進行獲取哥纫，但是它耗費人力，高通量受限痴奏；微流控可以對整個分選過程進行監(jiān)測蛀骇，但是依賴固定的微流控芯片
Smart-seq2： 提到單細胞不得不說這個技術，目前它和10X是最主流的建庫技術抛虫。它的重點是"測的少，但測得長“简僧。它以單個細胞或10pg的RNA為模板建椰，將Oligo(dT) VN Primer作為逆轉錄引物，利用逆轉錄酶的模板轉換（Template-switching）活性岛马，在cDNA的3’端添加一段接頭序列棉姐，通過該接頭序列進行后續(xù)PCR擴增，可以獲得全長cDNA擴增產物啦逆。它對RNA質量要求高伞矩，RNA降解對引起5’端信息丟失
結果
揭示小鼠乳腺癌CAFs亞群
采用負向篩選的FACS去除上皮細胞、免疫細胞夏志、內皮細胞和周細胞乃坤，從MMTV-PyMT轉基因小鼠腫瘤組織樣本中分選出EpCAM?/CD45?/CD31?/NG2?細胞類群（共構建了2個384孔板細胞=768個CAFs文庫）
然后smart-seq2測序，加入ERCC spike-in沟蔑，結果有52個質量不合格湿诊，然后去掉了細胞中平均表達量小于1的基因，得到了10835個內源基因和53個spike-in去做下游分析瘦材。平均每個細胞得到4600個差異基因厅须，然后進行降維，利用DBSCAN進行t-SNE分析食棕，鑒定了4個細胞亞群
得到亞群然后進行功能分析
利用ROTS（reproducibility-optimized test statistic）方法將每個群體和其他的混合群體對比尋找差異基因朗和，1-4號亞群分別得到522，1999簿晓，590眶拉，859個顯著差異表達基因(significantly differentially expressed，SDE憔儿，認為FDR<0.001)镀层，然后將每個亞群的前18個SDEs聚類畫熱圖。
另外為了檢測ROTS的準確性，又用SCDE唱逢、edgeR吴侦、DESeq2、Wilcoxon rank-sum test方法分析坞古，得到了類似的SDEs(見附表4)
然后利用每個群體的前150SDEs進行GO分析备韧，4個CAFs亞群命名為：vCAFs（血管發(fā)育和生成）、eCAFs（細胞外基質）痪枫、cCAFs（細胞周期）和dCAFs（組織發(fā)育）
細胞亞群在腫瘤中的時空分布
目的是確定4種CAFs的來源和分布织堂，繪制了SDE的小提琴圖，并結合免疫熒光奶陈、免疫組化等標記了亞群的marker基因：vCAFs=》Desmin易阳、NID-2、CD31吃粒；mCAFs=》PDGFRα潦俺；dCAFs=》SCRG1、EPCAM
推測分布：
- vCAFs起源于血管周細胞徐勃，隨后向腫瘤基質區(qū)域侵襲事示；
- mCAFs來源于組織常駐成纖維細胞；
- cCAFs為vCAFs的增殖狀態(tài)僻肖；
- dCAFs來源于腫瘤細胞肖爵，并發(fā)生了EMT轉化。
后來還將小鼠CAFs與TGCA中乳腺癌的bulk 轉錄組數據進行相關性分析
TCGA中的基因與vCAFs臀脏、mCAFs的SDE相關性更高
