「BioNano系列」光學(xué)圖譜混合組裝應(yīng)該怎么做？ 簡單的介紹了混合組裝的整體步驟，這一篇具體介紹它是如何生成hybrid scaffold表征的AGP和FASTA文件

MergeNGS_BN.pl的輸出結(jié)果是/MergeNGS_BN/step2.hybrid.cmap载城，之后RefAligner將conflict-resolved 序列和Bionano map比對到Hybrid scaffolds空入，方便檢查NGS和BNG對hybrid scaffold的貢獻(xiàn)碌宴。

這一步輸出結(jié)果在align_final文件夾下，分為xmap, _r.cmap 和_q.cmp文件籍滴，可以在BioNano Access上可視化酪夷。

例1

例2

例3

后續(xù)的scaffold構(gòu)建就依賴于物理圖譜和光學(xué)圖譜回帖到hybrid scaffold的聯(lián)配結(jié)果。

第一步孽惰，根據(jù)光學(xué)圖譜晚岭，物理圖譜和混合圖譜的比對結(jié)果，構(gòu)建AGP文件勋功。

主要目標(biāo)是從混合圖譜中對原始序列進(jìn)行拼接, 需要考慮3種情況

1. 混合圖譜中兩翼無序列覆蓋區(qū)
2. 混合圖譜中中間無序列覆蓋區(qū)
3. 一個區(qū)域有多個序列覆蓋

為了和NCBI的AGP兼容坦报，第一種情況的處理方法就是將混合圖譜中兩翼無序列覆蓋區(qū)直接刪除，保證其實序列不是N狂鞋。

第二種情況的解決方案就是用N進(jìn)行填充片择。其中N的數(shù)目來自于光學(xué)圖譜和物理圖譜距離比例換算，但是最低不低于固定值G, 默認(rèn)G是13.

第三種情況下骚揍，會采用覆蓋同一個區(qū)域中多條序列中最長的那條

第二步: 基于AGP文件信息字管，BioNano的Hybrid Scaffold流程對原始序列進(jìn)行拼接啰挪。最終產(chǎn)生2類FASTA文件，一類是未被用于混合組裝的序列嘲叔，文件命名里包含NOT_SCAFFOLD亡呵，另一類是由基因組序列和代表未知區(qū)域的N組成。每一類文件還會有額外的NCBI版本硫戈，也就是未知區(qū)域只能用N表示锰什。

最終在agp_fasta目錄下有下面這些文件, 不同項目的文件名或許有些不同，但差異不會太大

athaliana_BSPQ1_0kb_0labels_key.txt.cut.txt
athaliana.fasta.cut.fasta
EXP_REFINEFINAL1_bppAdjust_cmap_athaliana_fasta_NGScontigs_HYBRID_SCAFFOLD.agp
EXP_REFINEFINAL1_bppAdjust_cmap_athaliana_fasta_NGScontigs_HYBRID_SCAFFOLD.fasta
EXP_REFINEFINAL1_bppAdjust_cmap_athaliana_fasta_NGScontigs_HYBRID_SCAFFOLD.gap
EXP_REFINEFINAL1_bppAdjust_cmap_athaliana_fasta_NGScontigs_HYBRID_SCAFFOLD_NCBI.fasta
EXP_REFINEFINAL1_bppAdjust_cmap_athaliana_fasta_NGScontigs_HYBRID_SCAFFOLD_NOT_SCAFFOLDED.fasta
EXP_REFINEFINAL1_bppAdjust_cmap_athaliana_fasta_NGScontigs_HYBRID_SCAFFOLD_trimHeadTailGap.coord
EXP_REFINEFINAL1_bppAdjust_cmap_athaliana_fasta_NGScontigs_HYBRID_SCAFFOLD.xmap_sorted.xmap
xmap2agp.errlog
xmap2agp.log

對于scaffold中的gap丁逝，可以用一些補洞軟件汁胆，例如PBjelly進(jìn)行 gap filling

舉例說明

以下是AGP文件中其中一條scaffold的搭建情況

Super-Scaffold_9        1       2266237 1       W       ctg19_subseq_289397:2555633     1       2266237 -
Super-Scaffold_9        2266238 2266250 2       N       13      scaffold        yes     map
Super-Scaffold_9        2266251 2556219 3       W       ctg165  1       289969  -
Super-Scaffold_9        2556220 2556232 4       N       13      scaffold        yes     map
Super-Scaffold_9        2556233 2873797 5       W       ctg149  1       317565  -
Super-Scaffold_9        2873798 2873810 6       N       13      scaffold        yes     map
Super-Scaffold_9        2873811 11480417        7       W       ctg9    1       8606607 -

在BioNano access對應(yīng)的內(nèi)容如下

BioNano Access

對于開頭區(qū)域，雖然有很多NGS的contig比對到同一個區(qū)域霜幼，但是只會選擇其中最長的那條嫩码，其他則都可以當(dāng)做haplotype。

代表性

之后就需要接上另外一條contig辛掠。雖然從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)谢谦，這兩條contig其實存在一部分的重疊，最好的策略是將刪掉其中一部分萝衩，避免冗余回挽，但是Solve的做法其實是在兩個contig中加入13個N。

兩個contig的交接

其結(jié)果就是猩谊，導(dǎo)致該區(qū)域用重測序比對時出現(xiàn)多比對千劈，影響后續(xù)轉(zhuǎn)錄組預(yù)測

冗余的后果

后續(xù)的組裝BioNano 出現(xiàn)了一個明顯錯誤的操作，顯然1后面應(yīng)該直接接2牌捷，如果是這樣子處理墙牌，那么AGP文件中的記錄就應(yīng)該只出現(xiàn)2處N記錄，但實際上卻有三處暗甥，這說明BioNano實際的連接策略是1->3->2, 那么結(jié)果里在這里就會出現(xiàn)一處大規(guī)模的冗余

第二處連接點

我將二代測序的重測序和轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)行回帖喜滨，對該區(qū)域進(jìn)行檢查

ctg149 起始

ctg149 結(jié)束

ctg9 起始

同樣造成了多序列的比對，以及轉(zhuǎn)錄組錯誤組裝

解決方法： 不知道撤防，和BioNano公司討論中虽风。我目前就采用手工解決沖突的方法了。