作者蛋勺，Evil Genius

果然了凹髓，說了一聲單細胞數(shù)據(jù)關(guān)于call snp的事情，很多人過來咨詢這個怎么做奶陈。

單細胞數(shù)據(jù)call snp早就不是什么新鮮事情易阳，大家可以參考一下文章

10X單細胞空間數(shù)據(jù)分析之SNP檢測篇

cellsnp-lite

運行示例

cellsnp-lite -s $BAM -b $BARCODE -O $OUT_DIR -R $REGION_VCF -p 20 --minMAF 0.1 --minCOUNT 20 --gzip

可以拿到單細胞級別的突變信息，下面是整理的單細胞 X 基因位置突變的矩陣（以單細胞3'數(shù)據(jù)為例）,row是基因 + 染色體 + 位置 + ref +alt吃粒，column是barcode潦俺。

還是那句話，3‘數(shù)據(jù)是幾乎不能call snp的徐勃，唯有5'在某些情況下是可以的事示，例如KRAS的G12D突變。

還有就是單細胞空間聯(lián)合分析的軟件cytospace僻肖，CytoSPACE是一種通過全局優(yōu)化調(diào)整單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組的工具肖爵。與其他方法不同，CytoSPACE根據(jù)基于相關(guān)性的成本函數(shù)和每個點的細胞數(shù)量臀脏，確保全局最優(yōu)的單細胞/點對齊劝堪。此外法挨，它可以容易地擴展以適應(yīng)額外的限制，例如每個點的每種細胞類型的分數(shù)組成（例如由RCTD或cell2location 推斷）幅聘。

GitHub - digitalcytometry/cytospace: CytoSPACE: Optimal mapping of scRNA-seq data to spatial transcriptomics data

CytoSPACE_overview

n_cells_per_spot

CRC_cell_type_assignments_by_spot_single_cell

再來分享多組學的時候凡纳，我們重復(fù)一點，基因表達只是表象帝蒿、基因突變是根本荐糜，空間排布是微環(huán)境、VDJ是免疫反應(yīng)葛超。

今天參考的文獻在A cellular and spatial atlas of TP53-associated tissue remodeling in lung adenocarcinoma,最近的文章都在朝著多組學的方向發(fā)展暴氏，其中無論是單細胞空間還是科服，TP53這個基因應(yīng)該都不陌生绣张。

TP53是許多癌癥中最常見的突變基因答渔，并且與肺腺癌(LUAD)的較短生存期相關(guān)。為了確定TP53突變?nèi)绾斡绊慙UAD腫瘤微環(huán)境(TME)侥涵，文章構(gòu)建了23例treatment-na?ve人肺腫瘤的多組學細胞和空間腫瘤圖譜沼撕。

非小細胞肺癌(NSCLC)是一種異質(zhì)性疾病，通常被分為不同的組織學亞型芜飘。最近务豺，基因組改變已被用于表征非小細胞肺癌的分子亞型，可用于選擇具有特定基因組變化的患者的治療方法嗦明。酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)和其他針對致癌突變和染色體重排的靶向治療(如EGFR笼沥、KRAS-G12C、ALK)最近已導(dǎo)致NSCLC患者生存率的改善娶牌。免疫檢查點抑制劑(ICIs)治療(例如奔浅，抗PD -1/PD-L1)聯(lián)合化療或不聯(lián)合化療已被證明對一部分患者有效，目前是一些IV期非小細胞肺癌患者一線治療的一部分诗良。然而汹桦，由于癌癥的高復(fù)發(fā)率，迫切需要更有效的患者分層和精確治療方法累榜。

腫瘤蛋白p53 (TP53)是NSCLC中最常見的突變基因(約50%)以及許多其他癌癥营勤。TP53突變在吸煙者中更為常見灵嫌，并且與腫瘤進展和轉(zhuǎn)移相關(guān)壹罚，導(dǎo)致NSCLC患者的生存期較短。盡管TP53是研究最廣泛的腫瘤抑制因子寿羞，但由于報道的突變多樣性及其參與廣泛的調(diào)控途徑猖凛，TP53的靶向治療一直具有挑戰(zhàn)性。在小鼠模型中绪穆，已知TP53在腫瘤發(fā)展過程中對腫瘤微環(huán)境(TME)有影響辨泳。突變型TP53還與人肺腺癌(LUAD)患者PD-L1表達增加和抗PD1治療反應(yīng)改善相關(guān)虱岂，這促使研究TP53突變型(TP53^mut)與TP53野生型(TP53^WT) LUAD患者的TME差異。

多個treatment-na?ve可切除的NSCLC患者腫瘤的單細胞和空間分析可以促進對TP53突變癌細胞及其與TME的關(guān)系的基本理解菠红，并提供可能產(chǎn)生新的治療機會的見解第岖，但是，先前的研究尚未解決這個問題试溯。單細胞rna測序(scRNA-seq)先前已被用于表征可切除的非小細胞肺癌中的惡性細胞和TME蔑滓，重點關(guān)注原發(fā)腫瘤與鄰近正常組織、腫瘤進展期間或轉(zhuǎn)移部位之間的基因表達差異遇绞。研究還利用TME特征將NSCLC患者分層為臨床相關(guān)亞組键袱，可以預(yù)測對免疫治療的反應(yīng)。一項研究側(cè)重于表征EGFR^mut LUAD的TME和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性摹闽，但這些先前的scRNA-seq研究并沒有確定腫瘤中TP53的突變狀態(tài)蹄咖，也沒有研究其對TME中所有細胞區(qū)域的影響.

文章生成了迄今為止最全面的NSCLC多組圖譜，結(jié)合匹配的TP53^mut和TP53^WT人類腫瘤的全外顯子組測序付鹿、scRNA-seq澜汤、空間轉(zhuǎn)錄組學和多重免疫熒光，以確定惡性細胞和TME中TP53突變相關(guān)的變化舵匾。整合圖譜能夠識別空間驗證的細胞-細胞相互作用银亲，這些相互作用可能有助于塑造NSCLC的腫瘤結(jié)構(gòu)。在此過程中纽匙，發(fā)現(xiàn)了TP53^mut LUAD中的缺氧表達生態(tài)位务蝠，并確定了惡性腫瘤細胞限制TME中血管生長的可能機制。進一步發(fā)現(xiàn)烛缔，在TP53^mut與TP53^WTLUAD中馏段，T細胞區(qū)域具有高度耗損的特征，并伴隨著惡性細胞践瓷、T細胞和髓細胞之間多重免疫檢查點相互作用的富集院喜。最后，利用系統(tǒng)的方法檢測空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)中的細胞標志晕翠，觀察到一個潛在的促轉(zhuǎn)移組織生態(tài)位喷舀，由表達spp1的腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tam)和表達膠原的癌癥相關(guān)成纖維細胞(CAFs)組成，這些細胞與TP53^mut LUAD TME中的缺氧有關(guān)淋肾。

非小細胞肺癌的多基因組圖譜

為了表征NSCLC的分子硫麻、細胞和空間異質(zhì)性，進行了全外顯子組測序(WES)樊卓、scRNA-seq拿愧、空間轉(zhuǎn)錄組學(ST;10X Visium)和多重免疫熒光(mIF)對23例NSCLC患者的原發(fā)腫瘤切除進行了檢測，其中18例診斷為LUAD碌尔。23例患者中有21例有吸煙史(中位數(shù)40浇辜，范圍12-100包/年)券敌，所有患者在腫瘤切除術(shù)前均確認為treatment-na?ve。使用WES分析來確定非小細胞肺癌中常見的突變基因(包括TP53柳洋、EGFR待诅、KRAS、STK11熊镣、KEAP1咱士、RBM10和PTPRD)的總腫瘤突變負擔、拷貝數(shù)改變(CNAs)和突變狀態(tài)轧钓。從腫瘤匹配的WES預(yù)測的CNA譜與從scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷的CNA譜之間存在高度一致性序厉，其中許多與LUAD8中常見的缺失(如CDKN2A、PTPRD毕箍、B2M)和擴增(如NKX2-1弛房、TERT、MCL1而柑、EGFR)基因重疊文捶。經(jīng)過篩選，總共獲得了167,193個高質(zhì)量的細胞圖譜媒咳，并使用CNA推斷來區(qū)分惡性和非惡性上皮細胞粹排，然后根據(jù)已知標記基因的一致表達將它們整合、聚類并注釋為11個廣泛的細胞類別涩澡。通過TP53突變狀態(tài)來區(qū)分腫瘤顽耳，不同的TP53突變相對于TP53^WT LUAD腫瘤，在下調(diào)惡性細胞中TP53靶基因的平均表達方面具有相當?shù)男Ч钔Ｆ溆?例腫瘤包括鱗狀射富、黏液狀和膠體狀組織學，未用于TP53^mut和TP53^WT腫瘤的比較粥帚，因為已發(fā)現(xiàn)TP53突變對患者預(yù)后具有組織學依賴性.

TP53^mutLUAD與不同的TME組成有關(guān)

TP53^mut和TP53^WT LUAD腫瘤TME中的細胞亞群具有可區(qū)分的細胞內(nèi)在表達譜和細胞組成胰耗。特別是，在TP53^mut和TP53^WT的LUAD腫瘤中芒涡，內(nèi)皮細胞和周細胞的比例明顯下降柴灯，通過對來自癌癥基因組圖譜(TCGA)的510份原發(fā)性LUAD腫瘤的大量RNA-seq譜進行相應(yīng)的細胞類型特征評分，證實了這一點费尽。內(nèi)皮細胞異常與腫瘤細胞進展和轉(zhuǎn)移有關(guān)赠群，周細胞耗竭與乳腺癌中136例缺氧相關(guān)的上皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有關(guān)。

來自6個腫瘤的14個組織切片的空間轉(zhuǎn)錄組分析也支持了TP53^mut和TP53^WT LUAD之間的這些組成差異(2個TP53^mut和4個TP53^WT LUAD)依啰。另外2個腫瘤(6張幻燈片)的空間數(shù)據(jù)由于非LUAD組織學或惡性細胞數(shù)量不足而被排除在下游分析之外乎串。使用深度學習框架Tangram將腫瘤匹配的scRNA-seq圖譜映射到相應(yīng)的ST數(shù)據(jù)，并為每個空間測量生成細胞組成的概率測量速警。空間細胞組成推斷與肺病理學家對相應(yīng)的蘇木精和伊紅(H&E)染色的獨立手工注釋高度一致叹誉。與scRNA-seq一致，在TP53^mut和TP53^WT腫瘤樣本中闷旧，內(nèi)皮細胞和周細胞在ST點上的比例也有所下降长豁。

Spatially resolved, multi-omic atlas of NSCLC

Dichotomous activity of malignant cell programs in LUAD associates with survival

雖然來自一個腫瘤的惡性細胞可以占據(jù)表達狀態(tài)的梯度，而不是離散的細胞亞群忙灼，但在單細胞分辨率的LUAD中匠襟，還沒有全面定義不同的癌癥表達程序及其在細胞和腫瘤中的使用。為了識別腫瘤之間的共享細胞狀態(tài)该园，盡管惡性細胞存在顯著的患者特異性差異酸舍，使用典型相關(guān)分析(CCA)將惡性細胞整合并聚類到18個跨腫瘤共享的亞群中，并使用基因集富集分析注釋細胞亞群里初，突出代表性標記啃勉。這些亞群富含與標志性癌癥過程相關(guān)的基因(例如，細胞周期双妨、缺氧淮阐、糖酵解、部分EMT (pEMT)刁品、干擾素γ (IFNG)和TNFA信號傳導(dǎo))和與肺上皮細胞(例如泣特，肺泡2型(at2樣)、纖毛挑随、分泌型)状您。其他惡性細胞亞群表現(xiàn)出抗原呈遞(MHCII)、應(yīng)激反應(yīng)兜挨、金屬硫蛋白和衰老相關(guān)基因的顯著表達.

在將所有惡性細胞和腫瘤樣本相關(guān)聯(lián)后竞阐，聚集成兩組:一組由細胞周期、缺氧暑劝、pmt和糖酵解程序組成骆莹，另一組由肺泡樣、抗原呈遞和應(yīng)激反應(yīng)程序組成担猛。這兩組的惡性program評分呈強烈的反相關(guān)幕垦，表明它們受到兩種截然不同的相反途徑的調(diào)節(jié)。這與先前的LUAD研究一致傅联，其中來自患者來源的異種移植物的細胞由兩個不同的腫瘤內(nèi)亞組組成先改，由主要由細胞周期基因組成的基因模塊區(qū)分。在TCGA的LUAD患者腫瘤中蒸走，幾種惡性program(如ppt仇奶、缺氧、細胞周期比驻、金屬硫蛋白该溯、糖酵解)的高表達與較短的生存期相關(guān)岛抄。相反，抗原呈遞MHCII程序的高表達與延長生存期有關(guān)狈茉。

為了確定TP53^mut和TP53^WTLUAD惡性細胞之間的細胞內(nèi)在差異夫椭，比較了兩組患者之間不同惡性program的平均活性評分，發(fā)現(xiàn)在與較短生存期相關(guān)的幾個程序(如細胞周期氯庆、糖酵解蹭秋、pEMT)中，TP53^mut比TP53^WT LUAD的表達更高堤撵，而AT2樣程序和TP53靶點的表達降低仁讨，這與TP53^mut腫瘤在LUAD TCGA中較短生存期的觀察結(jié)果一致。在數(shù)據(jù)中实昨，TP53^mut和TP53^WT腫瘤的單核苷酸改變(SNAs)或CNAs的數(shù)量沒有統(tǒng)計學上的顯著差異洞豁。來自TCGA的263例TP53^mut和247例TP53^WT LUAD原發(fā)腫瘤的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)證實了惡性程序的差異。

TP53^mut LUAD中AT2樣程序表達的降低與AT2細胞身份的喪失是一致的屠橄。對腫瘤中每個惡性細胞譜的正常肺上皮細胞特征進行評分族跛，TP53^WT LUAD惡性細胞的AT2標記得分很高，而來自鱗狀锐墙、神經(jīng)內(nèi)分泌或粘液/膠體亞型腫瘤的細胞則表達預(yù)期的相應(yīng)基底礁哄、神經(jīng)內(nèi)分泌或杯狀特征。注意溪北，TP53^mut LUAD惡性細胞的AT2評分明顯低于TP53^WT LUAD桐绒，但與非腺癌亞型腫瘤的AT2評分相當，這表明肺泡細胞身份的喪失與LUAD的腫瘤進展有關(guān)之拨。

在不同的TP53變異和共突變類別中觀察到一致的癌癥內(nèi)在變化

為了了解EGFR和KRAS共突變對觀察到的TP53^mut LUAD癌癥內(nèi)在變化的潛在聯(lián)合影響茉继，將TCGA隊列(n=506)分為6個亞組，這些亞組對這三個基因具有不同的突變狀態(tài)蚀乔。與TP53^WTKRAS^WTEGFR^WT腫瘤相比烁竭，具有或不具有EGFR或KRAS共突變的TP53^mut腫瘤的TP53靶和AT2樣評分顯著降低，CC.G2/M評分顯著升高吉挣，而具有EGFR或KRAS突變的TP53^WT腫瘤與具有TP53^WTKRAS^WTEGFR^WT的腫瘤相比派撕，在這些特征上沒有顯著差異。注意睬魂，單獨發(fā)生TP53突變或與KRAS聯(lián)合而不與EGFR聯(lián)合的腫瘤糖酵解顯著增加终吼。與TP53^WTKRAS^WTEGFR^WT腫瘤相比，缺氧和pEMT評分表明EGFR突變抵消了TP53誘導(dǎo)的對這些惡性表達程序的影響氯哮，這與最近的一篇報道一致际跪。多元回歸分析還顯示，即使在剔除EGFR、KRAS (G12C姆打、G12D良姆、G12V以及所有KRAS突變一起)、STK11穴肘、KEAP1歇盼、RBM10和PTPRD突變的影響后舔痕，與TP53突變狀態(tài)相關(guān)的癌癥內(nèi)在變化也是一致的评抚。值得注意的是，在對模型輸出進行方差分析后伯复，TP53與KRAS或TP53與EGFR的突變狀態(tài)之間沒有顯著的相互作用慨代。

為了研究不同TP53突變變體對惡性基因程序表達變化的潛在影響，根據(jù)先前在TP53^WTA549 LUAD細胞系中過表達不同TP53^mut變體的功能研究定義的顯性陰性(DNE)啸如、功能喪失(LOF)和有效TP53突變類別對TCGA腫瘤樣本進行了劃分侍匙。與腫瘤scRNA-seq分析一致，TP53靶標和AT2樣評分降低叮雳，CC.G2/M想暗，糖酵解升高。低氧和pEMT評分與TP53 DNE和LOF突變或TP53影響突變亞類不同亞類的TCGA LUAD腫瘤相關(guān)帘不。DNE,LOF和impful II突變引起了最明顯的差異说莫，where Glycolysis.hypoxia and pEMT programs are significantly increased only in DNE,LOF and Impactful II variant categories in TCGA。此外寞焙，惡性細胞的許多內(nèi)在變化也在體外的A549 LUAD細胞(TP53WT)中被觀察到储狭，這些細胞過表達了廣泛的TP53突變變體，并通過Perturb-seq進行了分析捣郊。這些趨勢在所有突變類別中都存在辽狈，包括在患者腫瘤中發(fā)現(xiàn)的所有四種TP53變體，以及在scRNA-seq驗證中發(fā)現(xiàn)的一種變體呛牲。與TCGA一樣刮萌，在impact II突變中，惡性表達程序的變化最為明顯娘扩，而在過表達不同KRAS突變的A549 LUAD細胞中則不存在着茸。由于在廣泛的TP53突變中看到了惡性表達程序的一致變化，推斷這些表型變化與TP53^WT活性的喪失有關(guān)畜侦，而不是由任何特定突變引起的特定功能的獲得元扔。

最后，在蛋白水平上觀察到與TP53突變相關(guān)的表達變化旋膳。臨床蛋白質(zhì)組學腫瘤分析聯(lián)盟(CPTAC)的蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)顯示澎语，TP53靶和AT2樣特征評分持續(xù)下降，而CC.G2M在蛋白質(zhì)水平上的特征評分增加，其中DNE,LOF和impful II突變類別的影響再次最為明顯擅羞。

在TP53^mut人類腫瘤和小鼠模型中信號熵和惡性程序的保守變化

在具有致癌基因KRAS-G12D體細胞激活的小鼠的LUAD進展過程中尸变，肺泡細胞身份的喪失和向祖細胞樣高度可塑性細胞狀態(tài)(HPCS)的逆轉(zhuǎn)，在p53缺失的小鼠的腫瘤中(KP模型)比具有野生型p53的小鼠(K模型)的情況更嚴重减俏。與我們在人類腫瘤中的發(fā)現(xiàn)一致召烂，AT2樣程序評分顯著降低，CC.S娃承、缺氧奏夫、糖酵解、 pEMT顯著升高历筝。此外酗昼，關(guān)鍵缺氧轉(zhuǎn)錄因子Hif1a在KP與K惡性細胞中的表達更高。其中梳猪，我們沒有觀察到缺氧麻削、糖酵解的顯著增加。在體外TP53^mut和TP53^WT A549 LUAD細胞之間的缺氧或ppt程序春弥，表明腫瘤微環(huán)境對體內(nèi)形成這些惡性程序很重要呛哟。

在TP53^mut LUAD人類腫瘤、細胞系和小鼠模型中匿沛，肺泡II型細胞身份的持續(xù)喪失促使探索這種喪失對信號熵的影響扫责，`信號熵是衡量細胞可塑性的一個代表性指標·。分析發(fā)現(xiàn)俺祠，數(shù)據(jù)中公给，TP53^mut與TP53^WT在單細胞水平上的LUAD惡性細胞的信號熵增加，在更大的隊列中以及KP與K小鼠模型中通過bulk RNA-seq和蛋白質(zhì)組學譜證實了這一點蜘渣。這種熵的增加在TCGA的DNE淌铐、LOF和impful II TP53^mut腫瘤中最為顯著，在TP53-only突變體和TP53-KRAS共突變體中顯著蔫缸，而在TCGA的TP53-EGFR共突變體中不顯著腿准，這與惡性程序活性變化的趨勢一致。

細胞周期和pEMT程序在人類惡性亞群中顯示出最高的熵拾碌，與KP小鼠模型中描述的HPCS細胞狀態(tài)最相似吐葱。此外，在過表達突變型TP53的A549細胞中校翔，攜帶impact I和impact II TP53突變的細胞(包括在scRNA-seq和驗證隊列中發(fā)現(xiàn)的變體)的熵顯著增加弟跑。相反，在過表達不同類型KRAS突變的相同細胞中防症，熵沒有顯著變化孟辑，這表明觀察到的熵增加與TP53突變直接相關(guān)哎甲。總之饲嗽，來自TP53^WT LUAD腫瘤的惡性細胞具有抗原呈遞和AT2樣細胞程序炭玫，而來自TP53^mut LUAD腫瘤的惡性細胞具有高度熵、可塑性貌虾，并與預(yù)測不良預(yù)后的程序相關(guān)吞加，包括細胞周期、糖酵解尽狠、缺氧和pEMT.

TP53^mut LUAD的特點是惡性和間質(zhì)細胞之間的空間相互作用衔憨，已知會抑制血管化并促進EMT

接下來關(guān)注的是TP53^mut LUAD中內(nèi)皮細胞比例的下降。在TCGA LUAD的TP53突變體腫瘤中也觀察到這種關(guān)聯(lián)晚唇，無論是否存在KRAS和EGFR共突變巫财，并且在DNE,LOF TP53突變體中最為顯著.

為了研究血管化減少的潛在機制盗似，根據(jù)正常肺中內(nèi)皮細胞亞群的既定標記表達注釋了9個內(nèi)皮細胞亞群哩陕。這些細胞包括:aerocytes，一種專門負責肺泡氣體交換的毛細血管細胞(表達HPGD赫舒、EDNRB和SOSTDC1);動脈細胞(GJA5悍及、ENPP2);毛細血管細胞(CA4、FCN3);血管內(nèi)皮細胞(VEC)接癌，包括COL4A1+ VEC (VEC.COL4A1)心赶、循環(huán)(VEC. cycling)和干擾素刺激(VEC. ifn)亞群;淋巴細胞;肺靜脈細胞;以及全身靜脈細胞。在TP53^mut 與TP53^WT LUAD中缺猛，所有內(nèi)皮細胞中空氣細胞(以及較小程度上的動脈細胞)的比例下降缨叫，這進一步得到了使用scrna -seq衍生標記物進行反卷積的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的支持。這表明TP53^mut LUAD中的氣體交換相應(yīng)減少荔燎，從而導(dǎo)致腫瘤部位肺泡周圍區(qū)域的氧氣擴散減少耻姥，為腫瘤細胞存活提供了選擇性優(yōu)勢。

通過對配體-受體對的分析有咨，發(fā)現(xiàn)在TP53^mut LUAD中琐簇，惡性細胞和內(nèi)皮細胞之間的幾種已知抑制內(nèi)皮細胞生長和功能的相互作用富集，包括SEMA3A-NRP1和EPHB2-EFNB1座享。匹配腫瘤樣本的空間轉(zhuǎn)錄組學支持這些觀察結(jié)果婉商，顯示在TP53^mut和TP53^WT LUAD切片中，SEMA3A-NRP1和EPHB2-EFNB1配體受體對的表達具有顯著更高的空間相關(guān)性渣叛。綜上所述丈秩，分析觀察到TP53^mut LUAD中惡性細胞和內(nèi)皮細胞之間已知抑制相互作用的空間相關(guān)表達，這可能解釋了這些亞群和血管化的伴隨減少淳衙。

在非小細胞肺癌中蘑秽，間充質(zhì)細胞的異質(zhì)性及其在更快的腫瘤進展和更短的患者生存期中的潛在作用已被證實挽唉。腫瘤的間充質(zhì)細胞被劃分為13個亞群。兩個亞群與正常肺肌成纖維細胞最相似:CAF筷狼。COLs表達高水平的膠原(COL1A2, COL3A1, COL1A1)瓶籽，它們與最近描述的LRRC15+肌成纖維細胞和肌成纖維細胞共享標記，表達成纖維細胞和平滑肌細胞標記埂材。還注釋了兩個周細胞樣亞群塑顺，一個表達典型周細胞標記物(HIGD1B, 331 COX4I2)，一個表達COL4A2和EMT相關(guān)基因;氣道和血管平滑肌亞群俏险，肺泡(cafa . adh1b)和外膜(cafa . adventitial)成纖維細胞严拒，與最近描述的人肺泡和外膜成纖維細胞相對應(yīng);以及表達更高水平脂質(zhì)代謝(caf1 . apoe)、核糖體(caf1 . ribo)竖独、補體和趨化性(caf1 . complement)和干擾素刺激(caf1 . isgs)基因的成纖維細胞亞群裤唠。值得注意的是，沒有觀察到CAF亞群類似于正常的肺纖維肌細胞或脂肪成纖維細胞莹痢。通過pySCENIC推斷种蘸，不同的間質(zhì)亞群與不同的活性調(diào)控子相關(guān)，具有高的調(diào)控特異性竞膳。正如預(yù)期的那樣航瞭，循環(huán)CAFs具有活躍的E2F1調(diào)節(jié)因子，這是一種細胞周期調(diào)節(jié)因子;CAF.ISGs激活I(lǐng)RF7和STAT1調(diào)控坦辟，控制干擾素應(yīng)答基因;和CAF.COLs激活了一個TWIST1調(diào)控子刊侯，該調(diào)控子先前與癌癥中的EMT有關(guān)

根據(jù)推斷的CAF亞群在橫斷面空間轉(zhuǎn)錄組學spot的組成，周細胞與內(nèi)皮細胞的CAF在空間上顯著相關(guān)锉走。CAF_COLs與血管平滑肌和CAF_ADH1B, CAF_Complement與CAF_Adventitial滨彻，周細胞與CAF_ISGs，氣道平滑肌細胞與CAF_APO和CAF_Ribo挪蹭。在空間上亭饵，大多數(shù)間充質(zhì)亞群與惡性細胞呈負相關(guān)，表明成纖維細胞與腫瘤核心閉塞嚣潜。比較TP53^mut與TP53^WT之間LUAD冬骚、周細胞和CAF間充質(zhì)細胞亞群(在所有間充質(zhì)細胞中)的相對比例。ADH1B在TP53^mut LUAD中減少(在廣泛的細胞類別中觀察到)懂算，也得到了反卷積bulk rna測序的支持只冻。與內(nèi)皮細胞評分類似，無論是否存在KRAS和EGFR共突變计技，TCGA LUAD中TP53突變腫瘤的周細胞評分均顯著降低喜德，且這種降低在TCGA中DNE、LOF類TP53突變中最為顯著.

TGFB2-TGFBR2在TP53^mut與TP53^WT LUAD中具有顯著更高的空間相關(guān)性垮媒，間質(zhì)細胞與惡性細胞之間的TGFB2-TGFBR2和TGFBR2-TGFB3相互作用在TP53^mut與TP53^WT LUAD中富集舍悯，但富集不顯著航棱。在TP53^mut和TP53^WT LUAD中，VEGFA在肌成纖維細胞中的表達更高萌衬，這與先前的報道一致饮醇，即肌成纖維細胞可以在缺氧的情況下調(diào)節(jié)血管生成★踉ィ總的來說朴艰，TP53^mut LUAD中基質(zhì)細胞組成和空間組織的變化都伴隨著已知的抑制脈管系統(tǒng)和誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相互作用的富集。

在TP53^mut LUAD骨髓細胞中增加SPP1表達和免疫調(diào)節(jié)相互作用

髓系細胞在腫瘤進展中起著重要作用混移，可能是癌癥的一個令人信服的治療靶點祠墅。雖然非小細胞肺癌髓系細胞群具有普遍特征，但TP53突變對髓系細胞的影響及其與TME中惡性歌径、間質(zhì)和免疫區(qū)室的相互作用尚未在人類中進行詳細研究毁嗦。

髓系細胞分為14個亞群，與之前的NSCLC圖譜基本一致回铛，但TP53^mut和TP53^WT LUAD在組成上存在顯著差異狗准。其中包括TP53^mut - LUAD在TAM-FABP4細胞(類似于組織內(nèi)肺泡巨噬細胞(tam))中的比例顯著降低，以及表達spp1的tam (TAM.SPP1)的比例增加勺届。與此一致的是驶俊，在TCGA bulk RNA-seq數(shù)據(jù)中，SPP1的表達顯著增加免姿，在TP53^mut和TP53^WT LUAD腫瘤的骨髓偽散裝比較中培己，SPP1的表達更為顯著轴咱。CXCL9/10/11在TP53^mut塊狀TCGA LUAD腫瘤中的表達也升高。在scRNA-seq數(shù)據(jù)和TCGA bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的反卷積分析中分瘾，TP53^mut LUAD腫瘤中表達tam的CXCL9/10/11比例(TAM.CXCLs)也更高想鹰。值得注意的是紊婉，SPP1和CXCL9/10/11在EGFR或KRAS中沒有共突變的TP53突變腫瘤中，以及TCGA中DNE辑舷、LOF和impactii類TP53突變腫瘤中升高最為顯著喻犁。

TP53^mut和TP53^WT LUAD的髓系細胞亞群也與不同的細胞內(nèi)在基因程序相關(guān)，因此TP53^mut和TP53^WT腫瘤的髓系亞群之間差異表達的基因在EMT何缓、缺氧和干擾素反應(yīng)途徑中富集肢础，尤其是在TAM中。SPP1細胞碌廓。SPP1的表達先前與EMT传轰、LUAD的早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TCGA LUAD中獨立于TP53突變狀態(tài)的較短生存期有關(guān)。值得注意的是谷婆，在單個髓細胞中慨蛙，與SPP1表達最相關(guān)的基因在EMT辽聊、缺氧和糖酵解功能上富集，包括VEGF受體NRP1和FLT1期贫。為了支持這一觀察結(jié)果跟匆，最近發(fā)表的scRNA-seq研究摘要顯示，SPP1+巨噬細胞在纖維化肺疾病通砍、COVID-19肺和胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)中一致存在贾铝，這表明這些纖維化相關(guān)的SPP1+巨噬細胞在肺損傷和ECM重塑中的作用〔号粒總之垢揩，發(fā)現(xiàn)SPP1在TP53^mut LUAD髓系細胞中的表達增加，這與EMT和缺氧程序相關(guān)基因的誘導(dǎo)密切相關(guān)敛瓷。

為了確定可能導(dǎo)致TP53^mut LUAD中不同髓系的配體-受體相互作用叁巨，進行了差異配體-受體相互作用分析。據(jù)推測呐籽，TP53^mut LUAD中富集的相互作用包括VEGF- FLT1和NRP1-SEMA3A锋勺，它們參與髓系細胞向腫瘤部位的募集，以及惡性細胞和髓系細胞之間的TGFB2-TGFBR1相互作用狡蝶，已知這些相互作用可促進單核細胞向tam分化庶橱，這可能有助于解釋TP53^mut LUAD中單核-巨噬細胞數(shù)量的相對增加。此外贪惹，在TP53^mutmut LUAD中誘導(dǎo)的髓細胞和間充質(zhì)細胞之間的NRP1-VEGFA苏章、NRP1-VEGFB、FLT1-VEGFB和FLT1-PGF相互作用表明奏瞬，間充質(zhì)細胞可能有助于單核細胞向TME募集.

此外枫绅，骨髓細胞和B/T細胞之間的CXCL11-CXCR3相互作用在TP53^mut LUAD中富集，CXCR3由NK硼端、B和T細胞特異性表達并淋，CXCL11在TP53^mut LUAD的多髓細胞亞群中誘導(dǎo)，其中TAM_CXCLs中表達最多珍昨，TAM_CXCLs在TP53^mut LUAD中占髓細胞比例較高县耽。因此，骨髓細胞可能會增強TP53^mut LUAD中表達cxcr3的T細胞的募集镣典。最后兔毙，在TP53^mut LUAD中，SPP1介導(dǎo)的髓細胞和內(nèi)皮細胞或周細胞之間的相互作用顯著增加骆撇，這也得到了TP53^mut腫瘤中SPP1和CD44表達空間相關(guān)性增加的支持瞒御。因此，TP53^mut LUAD增加了通過SPP1神郊、CXCL11和其他TAM相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑參與單核細胞和淋巴細胞募集肴裙、TAM分化趾唱、缺氧、EMT和其他下游效應(yīng)功能的推定相互作用的表達蜻懦。

TP53^mut LUAD中T細胞耗竭程序的富集和假定的免疫檢查點相互作用

scRNA-seq數(shù)據(jù)中的淋巴樣細胞分為T和NK細胞甜癞、濾泡和邊緣帶B細胞、IgA和IgG漿細胞宛乃、漿細胞樣dc和肥大細胞等13個亞群悠咱。雖然B細胞組成沒有顯著差異，但TP53^mut LUAD的CD4+組織記憶T細胞(CD4- trm)比例降低征炼，在所有T細胞和NK細胞中析既，表達gzmk的CD8+ (CD8- gzmk)和431個耗盡樣(T. exhausted) T細胞群增加，這得到了scRNA-seq驗證和來自TCGA原發(fā)腫瘤的反卷積 bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的支持谆奥。耗竭T細胞的高豐度可能是通過CXCL11-CXCR3相互作用增加趨化性介導(dǎo)的眼坏，其中CXCR3在TP53^mut耗竭T細胞中上調(diào).

在scRNA-seq中，還觀察到TP53^mut和TP53^WT腫瘤中TFH細胞相對于所有T細胞和NK細胞的比例更高酸些，當合并所有樣本時宰译，這具有統(tǒng)計學意義。作為檢查點抑制治療應(yīng)答的主要預(yù)測因子魄懂，CXCL13的表達在耗盡樣亞群和TFH亞群中表達最高沿侈，并在TP53^mut腫瘤中顯著升高。此外市栗，TP53^mut腫瘤中免疫檢查點分子PDCD1缀拭、CTLA4、HAVCR2和TIGIT的表達在多個T細胞亞群中顯著高于TP53WT腫瘤肃廓，而癌癥預(yù)后良好的標志物KLRB1的表達則下調(diào)智厌。綜上所述，CXCL13和免疫檢查點分子(PDCD1盲赊、CTLA4、HAVCR2和TIGIT)的表達增加敷扫，TFH哀蘑、GZMK表達CD8+和耗竭樣T細胞的比例增加，都表明TP53^mut LUAD TME的免疫原性潛力增強葵第，這可能有助于更有利的ICI免疫治療反應(yīng).

對T細胞绘迁、髓細胞和惡性細胞之間假定的免疫檢查點相互作用的配體受體分析顯示，TP53^mut與TP53^WT LUAD中假定的T細胞與惡性細胞之間的相互作用中PDCD1-CD274和TIGIT-PVR的富集卒密，以及T細胞與髓細胞之間假定的相互作用中CTLA4-CD86和HAVCR2-LGALS9的富集缀台。事實上，分析發(fā)現(xiàn)來自TCGA的TP53^mut bulk RNA-seq LUAD腫瘤樣本中CD274哮奇、CD86膛腐、PVR睛约、PDCD1、CTLA4和TIGIT的表達較高哲身，來自CPTAC的TP53^mut蛋白質(zhì)組學LUAD腫瘤樣本中PVR和CD274的表達較高辩涝，以及在scRNA-seq數(shù)據(jù)中多個T細胞亞群中PDCD1、CTLA4和TIGIT的表達較高勘天，其中與CTLA4和PDCD1相比怔揩，TIGIT在T細胞中表達最頻繁。TP53^mut與TP53^WT腫瘤scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示脯丝，PVR在惡性細胞中的表達也更高商膊，且與惡性細胞中細胞周期程序的表達高度相關(guān)，提示PVR可能在癌細胞增殖過程中被激活宠进。此外晕拆，與TP53^WT相比，TP53^mut的LUAD中TIGIT和PVR表達的空間共定位明顯更高砰苍。與此一致的是潦匈，PVR+惡性細胞在TP53^mut腫瘤中比TP53^WT腫瘤中所占比例更高，在循環(huán)惡性細胞中更為顯著赚导。

為了在單細胞分辨率下研究PD-L1 (CD274)和PD1 (PDCD1)相互作用中TP53^mut的富集茬缩，對患者匹配的TP53^mut和TP53^WT福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)載玻片應(yīng)用了多重免疫熒光(mIF)。與TP53^WT相比吼旧，TP53^mut腫瘤樣本中PD-L1+細胞角蛋白+細胞以及PD1+CD8+細胞的對數(shù)計數(shù)密度(細胞/mm2)顯著增加凰锡，并且，與scRNA-seq細胞-細胞相互作用推斷一致圈暗，TP53^mut腫瘤樣本中PD-L1+細胞角蛋白+細胞和PD1+CD8+細胞之間的共定位增加掂为，通過多個空間分析測量直接接觸，鄰接性(由6個最近鄰居內(nèi)的細胞定義)和鄰近性(<50μm)员串。綜上所述勇哗，在TP53^mut LUAD中，PVR寸齐、TIGIT欲诺、CD274和PDCD1的表達增加，同時配體和相應(yīng)受體之間的共定位增加渺鹦。

在TP53^mut LUAD中扰法，空間定義的成纖維細胞-巨噬細胞生態(tài)位在缺氧和EMT程序中富集

為了利用空間數(shù)據(jù)全面繪制室間細胞共定位圖，對所有空間轉(zhuǎn)錄組學點上的細胞亞群比例進行了反卷積毅厚，并計算了所有LUAD切片上細胞類型比例的平均相關(guān)性塞颁，以及它們在TP53<sup>mut</sup>和TP53<sup>WT</sup> LUAD腫瘤之間的差異，有趣的是，在TP53^mut與TP53^WT LUAD中祠锣，內(nèi)皮細胞與間充質(zhì)細胞和髓系細胞的共定位(即更多的負相關(guān))明顯降低酷窥，這與TP53^mut腫瘤中間充質(zhì)和髓系亞群缺氧相關(guān)基因表達增加一致。此外锤岸，在TP53^mut LUAD中竖幔，B細胞、血漿細胞和惡性細胞的空間共定位增加是偷。B細胞浸潤與非小細胞肺癌中PD1/PD-L1表達增加拳氢、TMB增加和生存期延長有關(guān)，并可能導(dǎo)致TP53^mut LUAD腫瘤免疫原性增強蛋铆。

通過基于NMF的方法進一步確定了多細胞類群馋评，得出了15個不同細胞亞群參與的因素。因子7 (NMF7)含有已知在腫瘤進展中具有重要意義的多髓細胞和間充質(zhì)亞群刺啦，包括TAM留特，SPP1, CAF.COLs和肌成纖維細胞，它們彼此高度共定位玛瘸，以及具有標志性的缺氧和EMT程序表達蜕青。NMF7高表達點在惡性細胞中比例低，在髓細胞和間充質(zhì)細胞中比例高糊渊。在TP53^mut和TP53^WT LUAD中右核，NMF7與腫瘤周圍(惡性細胞≤50%的斑點)的標志性缺氧和EMT程序表達呈正相關(guān)，與所有斑點的內(nèi)皮細胞負相關(guān)渺绒。由于CAFs和巨噬細胞都被認為在腫瘤中誘導(dǎo)EMT, NMF7可能代表一個位于腫瘤核心周圍的缺氧成纖維細胞-巨噬細胞生態(tài)位贺喝，可能有助于TP53^mut LUAD惡性細胞的早期EMT表型.

生活很好，有你更好宗兼，我們下一篇總結(jié)方法躏鱼。