前期文章：
- 我們用兩篇文章的篇幅大概講了一遍質(zhì)粒骨架及其各個(gè)要素的介紹：
解剖式學(xué)習(xí)一個(gè)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)--update
質(zhì)粒系列之什么是質(zhì)粒 - 再談了最傳統(tǒng)的限制性克隆：
質(zhì)粒系列之限制性克隆--restriction cloning - 前面還夾雜的講過一些piggybac糖赔、gateway抄谐、RMCE的一些內(nèi)容：
基因編輯如何換藥不換湯 -
慢病毒系列也有講過兩篇：
團(tuán)隊(duì)作案HEK293，史上最強(qiáng)搬磚細(xì)胞
不想再用慢病毒了，我還有什么別的選擇嗎？piggyBac transposon - 此外我們本還有一個(gè)CRISPR screening的專題，只有開頭，未得完善：精準(zhǔn)大海撈針--5. CRISPR screening專題
- 質(zhì)粒系列之再談無(wú)縫連接--Gibson assembly
- Golden Gate酪惭，質(zhì)粒改造的王者
- 關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)的脫靶效應(yīng)：CRISPR-Cas9基因編輯--脫靶效應(yīng)如何檢測(cè)
- CRISPR和TP53文獻(xiàn)解讀之：Cas9誘導(dǎo)P53激活并導(dǎo)致細(xì)胞死亡
在上一篇文章中我們解讀了，CRISPR-Cas9基因編輯誘導(dǎo)DSB（DNA雙鏈斷裂）并最終導(dǎo)致人多功能干細(xì)胞死亡的內(nèi)容者甲。其中最關(guān)鍵的是Cas9造成的DSB春感，激發(fā)野生型P53反應(yīng)，P53激活后將細(xì)胞引入凋亡之路虏缸。話不多說鲫懒，直接看下圖：
想象一下這個(gè)過程：
（1）一個(gè)sgRNA-Cas9復(fù)合體在細(xì)胞核內(nèi)游走，Cas9蛋白在DNA序列上快速的掃描PAM序列寇钉，合適的停頓一會(huì)兒刀疙，DNA解鏈舶赔，sgRNA嘗試互補(bǔ)配對(duì)扫倡。配對(duì)失敗，此處不留爺自有留爺處竟纳！匹配成功撵溃，請(qǐng)看下一點(diǎn)。
（2）Cas9識(shí)別到NGG的PAM序列后锥累，sgRNA配對(duì)成功缘挑，Cas9蛋白切割PAM序列下游第三個(gè)堿基處（說是這么說，總也有切偏的時(shí)候）桶略，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB）语淘。
（3）DSB發(fā)生在WT-P53（野生型P53）的細(xì)胞中，P53激活誘導(dǎo)該細(xì)胞走向：周期阻滯际歼、衰老甚至凋亡惶翻。由于人多功能干細(xì)胞對(duì)DSB十分敏感，其P53反應(yīng)也十分激烈鹅心，容易走向凋亡吕粗。這就是上一篇文章的主要發(fā)現(xiàn)。
（4）而當(dāng)DSB發(fā)生在mutant-P53（突變型P53）的細(xì)胞中時(shí)旭愧，也有幾種情況：（A）該細(xì)胞有雙鏈P53突變颅筋，則毋庸置疑宙暇，P53功能缺失，不再誘導(dǎo)凋亡议泵，細(xì)胞得以存活占贫；（B）該細(xì)胞有一條鏈為WT-P53，另一條鏈為mutant-P53先口，當(dāng)這個(gè)細(xì)胞足夠倒霉的時(shí)候靶剑，它的mutant-P53鏈產(chǎn)生的mutant-P53蛋白，不僅自己不起功能池充，還反而抑制另外一條WT-P53起作用桩引！簡(jiǎn)直壞透了！此時(shí)無(wú)論如何收夸，細(xì)胞仍然不會(huì)有正常的P53反應(yīng)坑匠，細(xì)胞得以存活，且這些mutant-P53可能會(huì)繼續(xù)傳遞給后代卧惜，mutant細(xì)胞群不斷壯大厘灼！
綜上所述，顯而易見咽瓷，CRISPR-Cas9技術(shù)儼然成為一個(gè)篩選mutant-P53細(xì)胞的篩選因子设凹。長(zhǎng)此以往，mutant-P53群落越來越大茅姜。P53自己突變就算了闪朱，關(guān)鍵是當(dāng)其他的DNA損傷或者基因突變發(fā)生時(shí)，P53不再執(zhí)行其“基因衛(wèi)士”的功能钻洒，使得這些DNA損傷或者突變得以傳遞給后代奋姿，當(dāng)DNA突變積累足夠多/巧的時(shí)候，腫瘤可能會(huì)發(fā)生素标。這就是CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)称诗。想想有了前面那樣一篇文章，那么后面這篇文章的出現(xiàn)是不是可以理解头遭。
文章解讀：Cas9激活P53并富集P53突變
文章發(fā)表在2020年的Nature Genetics雜志
經(jīng)過2018年Nature Medicine的文章寓免，該文就是明確指出DSB激活P53信號(hào)，同時(shí)他們做的P53 mutant pool在CRISPR-Cas9編輯中能存活计维，也指示CRISPR-Cas9的mutant-P53富集作用袜香。是不是別人無(wú)法再做類似甚至相同的內(nèi)容了呢？但這篇文章又緣何可以發(fā)這么高分享潜？
1. 背景和科學(xué)問題
背景：Cas9通常被投入到細(xì)胞系中困鸥，以實(shí)現(xiàn)CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯。
問題：Cas9表達(dá)本身所造成的后果未知。（個(gè)人思考：角度非常好疾就，Cas9其實(shí)作為一種外源蛋白是否會(huì)引起免疫反應(yīng)澜术？Cas9是否會(huì)不依賴sgRNA直接切割，就如同一些核酸內(nèi)切酶的星號(hào)活性一樣猬腰？）
目的：研究Cas9表達(dá)本身是否會(huì)引起基因組或者轉(zhuǎn)錄組的變化鸟废，其后果如何
補(bǔ)充背景：中性基因編輯/操作（人為而非自然選擇）可導(dǎo)致細(xì)胞系的遺傳和轉(zhuǎn)錄多樣化。例如人為的過表達(dá)或者敲除某些基因都會(huì)改變細(xì)胞系的遺傳和轉(zhuǎn)錄多樣化姑荷。然而盒延，目前還不清楚引入特定的“中性”基因是否會(huì)對(duì)特地基因進(jìn)行富集或篩選。尤其是Cas9這樣常常使用的工具蛋白鼠冕。
2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和主要結(jié)果
2.1 Cas9過表達(dá)細(xì)胞和其親本細(xì)胞對(duì)比：查看轉(zhuǎn)錄組變化（基因富集情況）
L1000測(cè)序+GSEA分析（如下圖）：首先作者找到了165對(duì)Cas9過表達(dá)細(xì)胞及其親本細(xì)胞添寺，分別進(jìn)行L1000測(cè)序。L1000測(cè)序即對(duì)987個(gè)landmark基因進(jìn)行測(cè)序懈费，以推測(cè)余下11350個(gè)基因的表達(dá)（就是測(cè)重要基因表達(dá)）计露。這里的技術(shù)重復(fù)不是我們?cè)赗NA-seq中常見到的3個(gè)，而是高達(dá)16個(gè)憎乙。經(jīng)由L1000測(cè)序后發(fā)現(xiàn)有87個(gè)差異基因且差異在2倍以上票罐，經(jīng)由GSEA分析對(duì)比。證明Cas9過表達(dá)本身對(duì)遺傳背景有擾動(dòng)泞边。
數(shù)據(jù)分析（如下圖）：（1）左圖c表示该押，P53 WT細(xì)胞上，可見Cas9過表達(dá)細(xì)胞群有P53相關(guān)基因上調(diào)阵谚。而在P53 mutant組蚕礼，Cas9組和對(duì)照組的P53相關(guān)基因無(wú)差別（自然了，都突變了還能有下游基因變化么）椭蹄。（2）右圖g表示闻牡，在40個(gè)P53 WT的細(xì)胞中净赴，有相當(dāng)一部分細(xì)胞在Cas9過表達(dá)后表現(xiàn)出P53相關(guān)激活基因富集的現(xiàn)象绳矩。因此，Cas9激活P53得到了直接證據(jù)玖翅，同時(shí)Cas9激活P53這個(gè)現(xiàn)象大部分發(fā)生在P53 WT組上翼馆。原文中有相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)表格可查。
注意：這里僅僅是列舉了部分代表性結(jié)果金度，作者還做了P53应媚、P21的WB、PCR驗(yàn)證猜极，同時(shí)還測(cè)試通過免疫熒光提供了Cas9誘導(dǎo)DNA損傷的證據(jù)中姜。
2.2 P53 WT細(xì)胞及其Cas9過表達(dá)株對(duì)比：基因突變情況
基于上述結(jié)果：P53WT組，Cas9導(dǎo)致--細(xì)胞DNA損傷--P53激活--細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制、死亡丢胚。那Cas9相當(dāng)于變相的篩選富集P53 mutant細(xì)胞翩瓜。
Deep (283×) targeted exon sequencing for 447 cancer genes：于是作者找到42對(duì)P53WT狀態(tài)的細(xì)胞及其Cas9過表達(dá)株，對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行447個(gè)癌癥相關(guān)基因的深度測(cè)序携龟。經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)Cas9過表達(dá)細(xì)胞相對(duì)于WT細(xì)胞有更多的非同義突變（下圖a）兔跌。同時(shí)突變累積TOP3為：SETBP1（與DNA復(fù)制相關(guān)）、SLC25A13（線粒體載體家族基因）以及TP53基因峡蟋。<u>這里有一個(gè)疑問坟桅，TP53不是Top1呀，為啥不研究Top1呢蕊蝗？注意后文有回答</u>仅乓。
補(bǔ)充背景：深度測(cè)序是指對(duì)一個(gè)基因組區(qū)域進(jìn)行多次測(cè)序，深度可達(dá)數(shù)百次甚至數(shù)千次蓬戚。這種測(cè)序可檢測(cè)到只占原始樣本1%的罕見克隆類型方灾、細(xì)胞或微生物。深度測(cè)序?qū)Π┌Y碌更、微生物學(xué)和其他涉及罕見細(xì)胞群分析的研究很有幫助裕偿。例如，深度測(cè)序可識(shí)別腫瘤中的突變痛单，因?yàn)樵诎┌Y樣本中通常包含有許多正常細(xì)胞嘿棘，且腫瘤本身可能包含多種亞克隆。因此本文選用深度測(cè)序旭绒，可識(shí)別到微量的基因突變鸟妙，從而區(qū)分不同基因突變的亞群。
2.3 Cas9是否只特異性富集TP53突變挥吵？
從深度測(cè)序結(jié)果來看重父，不止TP53突變?cè)贑as9過表達(dá)株中富集。那么Cas9富集基因突變細(xì)胞是沒有bias還是特定富集TP53突變忽匈。為了解決這個(gè)問題房午，作者設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)：
細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)：作者將TP53 -null細(xì)胞用GFP標(biāo)記，將P53-null細(xì)胞和WT-P53細(xì)胞按照1:6混勻丹允，并分組處理：（1）無(wú)處理組NIC郭厌；（2）空載組EV；（3）Cas9過表達(dá)組Cas9雕蔽。經(jīng)分組處理后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP細(xì)胞占比變化折柠，如下圖b所示，Cas9組的TP53-null細(xì)胞在14,21天培養(yǎng)后群體壯大批狐，而ARID1A-null扇售、FBXW7-null細(xì)胞則沒有變化（下圖c）。因此<u>Cas9只特異性富集TP53突變細(xì)胞</u>，于是回答了2.2中我們提到的問題承冰。
2.4 summary
以上是本文的主要內(nèi)容嘱根，當(dāng)然后續(xù)作者還對(duì)CRISPR-Cas9導(dǎo)致TP53突變富集的機(jī)制進(jìn)行了研究和分析，說是在TP53-WT細(xì)胞中巷懈，cas9誘導(dǎo)的DNA損傷增加了對(duì)功能性DNA修復(fù)機(jī)制的依賴该抒，也做了一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，感興趣的小伙伴需要回原文查看顶燕。最后該文提供了一個(gè)使用Cas9進(jìn)行研究的工作流程圖凑保，我想這是該文的另一精髓：
（1）首先思考使用的Cas9過表達(dá)細(xì)胞是否有是WT-P53。如果不是涌攻，則無(wú)需太但又P53對(duì)功能實(shí)驗(yàn)的影響欧引；如果是，則需要檢查P53通路的激活狀態(tài)恳谎，可選用WB, RT-qPCR試驗(yàn)等芝此。
（2）若Cas9細(xì)胞有一定的P53通路激活，則：在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中考慮p53活性的基礎(chǔ)水平因痛；盡量避免過多傳代Cas9細(xì)胞婚苹，以免TP53 mutant細(xì)胞富集。
（3）即使Cas9細(xì)胞有P53活性基礎(chǔ)水平鸵膏，但仍需是否混有TP53 失落亞型細(xì)胞：可通過DNA測(cè)序鑒定膊升。
（4）鑒定Cas9過表達(dá)細(xì)胞株的DNA損傷水平，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中監(jiān)控DNA損傷水平的變化谭企，定期檢測(cè)TP53突變狀態(tài)廓译。
3. 小結(jié)
這篇文章使用了多種測(cè)序技術(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)巧妙债查，雖不多但都在刀刃上非区，是一篇很好的干濕結(jié)合文章，值得一讀盹廷，且文末討論簡(jiǎn)潔而精彩征绸。上文講的是CRISPR-Cas9誘導(dǎo)DSB導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這篇講的是CRISPR-Cas9無(wú)法使得TP53 mutant細(xì)胞死亡速和，簡(jiǎn)直是天生一對(duì)歹垫。那么CRISPR-Cas9是依賴DNA修復(fù)的技術(shù)，TP53是DNA修復(fù)的上游信號(hào)颠放，是否CRISPR-Cas9對(duì)DNA修復(fù)功能也有影響呢？下一次吭敢，我們將解讀一篇關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用中碰凶，TP53狀態(tài)和DNA修復(fù)之間的糾纏。
TP53是一個(gè)熱門IP，過了這么多年仍然有大量的好文章發(fā)表欲低，關(guān)于TP53和CRISPR-Cas9之間關(guān)系的好文章不僅僅這兩篇辕宏，我們希望能在這段時(shí)間把這類型的經(jīng)典文章讀一遍，加深我們對(duì)CRISPR-Cas9技術(shù)的理解砾莱。感謝大家閱讀瑞筐，再次期盼反饋交流！
