測序知識(shí).png
測序過程和原理
一代測序（Sanger測序）
- 原理：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基影斑，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵惧磺，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)邑遏。在4個(gè)DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP括眠，得到片段大小不一致的DNA混合物绘盟，然后通過凝膠電泳分離和放射自顯影后識(shí)別確定待測分子的DNA序列刨沦。
- 特點(diǎn)：讀長長（1000 bp）诗宣，準(zhǔn)確性高（99.999%），通量低想诅。
二代測序（NGS測序）
- 原理：邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis召庞，SBS）
在Sanger等測序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新侧蘸，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP裁眯，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光讳癌，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過特定的計(jì)算機(jī)軟件處理穿稳，從而獲得待測DNA的序列信息。
- 特點(diǎn)：通量高晌坤、時(shí)間短逢艘、讀長短。
- 平臺(tái)介紹
Roche公司的454技術(shù)骤菠、
Illumina公司的Solexa技術(shù)
Life technologies（ABI）公司的SOLiD技術(shù)（Ion Torrent和Ion Proton） - 流程
- DNA文庫構(gòu)建
將基因組DNA隨機(jī)片段化它改，然后通過末端修復(fù)、磷酸化商乎、加A等步驟修補(bǔ)成平末端央拖，最后加上特定的接頭（Adaptor），構(gòu)建成DNA文庫。 - 簇的生成——橋式PCR
Flowcel上面連有兩種接頭（P5鲜戒、P7）专控，當(dāng)DNA經(jīng)變性后流經(jīng)Flowcell時(shí)，利用Flowcell上的接頭與DNA兩端的接頭相互匹配遏餐。DNA進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增伦腐，從而將堿基信號(hào)放大。通過橋式PCR不斷循環(huán)獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段失都。 - 測序
- 數(shù)據(jù)產(chǎn)出
三代測序
- 原理：
- SMRT技術(shù)：
也采用邊合成邊測序方法柏蘑，以SMRT芯片為測序載體，芯片上眾多小孔中的DNA聚合酶和模板結(jié)合粹庞，4色熒光標(biāo)記4種堿基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP)咳焚，在堿基配對(duì)階段，加入不同堿基會(huì)發(fā)出不同的光信粮，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型黔攒。另外，若堿基存在修飾强缘，則通過聚合酶的速度會(huì)減慢督惰，因此可以通過檢測相鄰兩個(gè)堿基之間的測序時(shí)間、兩峰之間的距離來檢測甲基化等堿基修飾情況旅掂。SMRT測序速度快（每秒約數(shù)個(gè)dNTP）赏胚，但是，測序錯(cuò)誤率也較高（達(dá)到15%商虐，可通過多次測序進(jìn)行有效的糾錯(cuò)）觉阅。- 納米孔單分子測序技術(shù)：
該技術(shù)的原理是當(dāng)在膜兩側(cè)施加電壓，分子馬達(dá)驅(qū)動(dòng)DNA分子通過納米孔秘车，導(dǎo)致電荷發(fā)生變化典勇，每種堿基引起的電流變化是不同的，通過檢測這些電流進(jìn)而轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的堿基序列叮趴。
特點(diǎn)：無需PCR擴(kuò)增割笙，讀長長，無視GC含量的影響眯亦。
平臺(tái)
PacBio 實(shí)時(shí)單分子測序
Complete Genomics公司的復(fù)合探針-錨定連接技術(shù)
Oxford Nanopore 納米孔單分子通道技術(shù)
Ion Torrent電子流檢測技術(shù)注：以上內(nèi)容均摘自微信公眾號(hào) “生信星球”
選修
Filezilla能干什么伤溉？
（1）你的電腦和你的服務(wù)器之間互傳文件
（2）從數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)到你的電腦（然后傳到你自己的服務(wù)器）
Filezilla是什么？
（1）filezilla是圖形界面的FTP工具
（2）FTP--File Transfer Protocol妻率，文件傳輸協(xié)議乱顾。
下載公共數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)。
SFTP---SecureFile Transfer Protocol宫静，安全文件傳送協(xié)議走净。
自己電腦和自己服務(wù)器互傳券时。
FileZilla下載教程
百度/google上搜索 FileZilla ,進(jìn)入英文官網(wǎng) https://filezilla-project.org/，
- 完成下載
Filezalia的安裝和使用
-
你的電腦和你的服務(wù)器之間互傳文件
打開Filezalia
ctrl+S打開站點(diǎn)管理器
用filezilla登錄你的服務(wù)器
原始界面
-
點(diǎn)擊連接
-
注意：主機(jī)處填入的數(shù)字是你的服務(wù)器ip地址伏伯，打開你的putty應(yīng)該可以看到
- 從數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)到你的電腦
- 示例網(wǎng)址革为，復(fù)制粘貼 ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/M_musculus/ARCHIVE/MGSCv3_Release3/RNA/
-
點(diǎn)“快速連接”
