這一篇我們繼續(xù)分享單細(xì)胞空間聯(lián)合分析解決我們的生物學(xué)問題点把，這一次我們要分享的生物學(xué)問題是基底細(xì)胞瘤與其微環(huán)境的相互作用和腫瘤生長機制，當(dāng)然了，一旦涉及微環(huán)境的研究晰奖，單細(xì)胞空間兩種技術(shù)都是必需的肿仑，今天我們參考的文獻(xiàn)在Single-cell analysis of basal cell carcinoma reveals heat shock proteins promote tumor growth in response to WNT5A-mediated inflammatory signals致盟，一起來看看文獻(xiàn)的內(nèi)容。

科普一下：

• basal cell carcinoma (BCC) ：基底細(xì)胞瘤尤慰，基底細(xì)胞瘤亦稱蠶蝕性潰瘍馏锡，是皮膚癌中最多見的一種，發(fā)病率很高伟端，占眼瞼惡性腫瘤的第一位（約50%以上）杯道。男性比女性稍多，老年人比青年人多見责蝠，年齡高峰在50～60歲之間蕉饼。特征性皮損為具有珍珠樣隆起性邊緣的圓形斑塊虐杯，表面常有毛細(xì)血管擴(kuò)張，皮損逐漸增大昧港。一般僅在局部呈浸潤性生長擎椰，很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，但處理不當(dāng)创肥，或不加處理达舒，也可能嚴(yán)重破壞眼部組織，甚至侵入鼻旁竇及顱內(nèi)而引起死亡叹侄。

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Abstract

基底細(xì)胞癌 (BCC) 如何與其腫瘤微環(huán)境相互作用以促進(jìn)生長尚不清楚巩搏。在這里，使用單細(xì)胞 RNA 測序來定義人類 BCC 生態(tài)系統(tǒng)并區(qū)分正常和惡性上皮細(xì)胞趾代。確定了腫瘤及其周圍基質(zhì)的空間生物標(biāo)志物（空間位置還是很必要的）贯底，這些生物標(biāo)志物加強了每種組織類型的異質(zhì)性。結(jié)合基質(zhì)細(xì)胞中的偽時間撒强、RNA 速度禽捆、細(xì)胞熵和調(diào)節(jié)子分析揭示了成纖維細(xì)胞的癌癥特異性重新分布，其中 STAT1飘哨、TGF-β 和炎癥信號誘導(dǎo)非典型 WNT5A 程序胚想，維持基質(zhì)炎癥狀態(tài)。細(xì)胞間通訊模型表明芽隆，腫瘤通過產(chǎn)生熱休克蛋白來響應(yīng)成纖維細(xì)胞特異性炎癥信號通路的突然爆發(fā)浊服，在原位驗證了這一點。最后胚吁，使用 HSP70 抑制劑進(jìn)行劑量依賴性治療可抑制 BCC 小鼠模型中的體外 BCC 細(xì)胞生長和 Hedgehog 信號傳導(dǎo)以及體內(nèi)腫瘤生長牙躺，從而驗證了 HSP70 在腫瘤生長中的重要作用，并加強了 BCC 進(jìn)展中腫瘤微環(huán)境串?dāng)_的關(guān)鍵性質(zhì)腕扶。

Introduction

基底細(xì)胞癌 (BCC) 是一種局部浸潤性皮膚癌孽拷，是世界范圍內(nèi)最常見的人類癌癥秤茅，估計終生風(fēng)險在 20-30% 之間奕纫，并且在包括North America附迷、Europe茅诱、Asia和Australia在內(nèi)的許多地區(qū)發(fā)病率不斷上升厨钻。 BCC 源于 Hedgehog (HH) 信號通路的不當(dāng)激活栈戳，其中分泌的 HH 配體結(jié)合膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白 Patched Homologue 1 (PTCH1) 并抵消 PTCH1 介導(dǎo)的 G 蛋白偶聯(lián)受體平滑 (SMO) 抑制牡彻。 然后 SMO 激活 GLI 轉(zhuǎn)錄因子家族以促進(jìn)增殖和腫瘤生長腔呜。 盡管 BCC 的死亡率低棉磨，但受累的患者人數(shù)眾多江掩，發(fā)病率和成本都很高。

盡管手術(shù)仍然是 BCC 治療最好的方法，但對于美容敏感的身體部位的腫瘤或轉(zhuǎn)移性疾病环形，它不是一個實用的選擇策泣。 SMO 抑制劑 vismodegib 和 Sonidegib 已成為晚期疾病的有希望的治療方法，在轉(zhuǎn)移性 BCC 中的反應(yīng)率約為 30%抬吟，在局部晚期 BCC 中為 45%萨咕。 然而，驅(qū)動耐藥性的 SMO 突變很常見火本，在接受 vismodegib 治療的患者中危队，發(fā)現(xiàn)高達(dá) 21% 的患者在治療期間經(jīng)歷了腫瘤再生長。 導(dǎo)致 BCC 耐藥性的其他途徑包括 PI3K/MTOR钙畔、WNT茫陆、aPKC iota/lambda、NOTCH1擎析、RAS/MAPK 和 MRTF 的激活簿盅，僅舉幾例。 所以需要新的治療選擇來治療晚期 BCC揍魂。

基質(zhì)如何與 BCC 相互作用并促進(jìn)其生長尚不清楚桨醋。根據(jù) BCC、鱗狀細(xì)胞癌和黑色素瘤中癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF) 標(biāo)志物的層次聚類愉烙，可以將三個不同的亞組分層讨盒，每個亞組對應(yīng)于特定的癌癥類型解取。具體而言步责，BCC CAF 以其 PDGFR-β、S100A4 和 TWIST 的高表達(dá)而著稱禀苦。在 BCC 的不同組織病理學(xué)亞型中蔓肯，腫瘤與基質(zhì)的比率顯著不同，浸潤性 BCC 的比率最低振乏。編碼細(xì)胞外基質(zhì)成分的基因在 BCC 中也被上調(diào)蔗包，表明腫瘤誘導(dǎo)的基質(zhì)基質(zhì)重塑。此外慧邮，基質(zhì)蛋白的表達(dá)已被證明可以預(yù)測 BCC 的侵襲性并區(qū)分浸潤性 BCC 和促纖維增生性毛上皮瘤调限。總之误澳，這些研究表明 BCC 基質(zhì)中的表達(dá)因子可以在腫瘤生長耻矮、血管生成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。定義 BCC-基質(zhì)相互作用可能是腫瘤進(jìn)展的一個重要但未充分研究的部分忆谓，并導(dǎo)致更有效的治療裆装。

單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 技術(shù)允許分析樣本內(nèi)異質(zhì)性、腫瘤/樣本微環(huán)境、致病途徑和致癌環(huán)境中的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用（單細(xì)胞確實是一個開創(chuàng)性的技術(shù)）哨免。 使用這項技術(shù)茎活，分析定義了 BCC 細(xì)胞異質(zhì)性、細(xì)胞間相互作用和 BCC 中的新活性途徑琢唾。 區(qū)分惡性和正常上皮細(xì)胞载荔，確定由 WNT5A 驅(qū)動的基質(zhì)炎癥反應(yīng)，表征過度表達(dá)熱休克蛋白的 BCC 角質(zhì)形成細(xì)胞亞群采桃，并提供支持 HSP 通路作為 BCC 潛在新治療靶點的數(shù)據(jù)身辨。

Results

Cellular ecosystem of human BCC

為了定義人類 BCC 的cellular ecosystem，從原代人類 BCC 手術(shù)丟棄物（n = 4）芍碧，包括腫瘤周圍正常皮膚（PTS）組織（n = 2）中分選了可行的單細(xì)胞煌珊，并將它們置于 3 '-啟用液滴的 scRNA-seq 。

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研究中考慮的主要 BCC 亞型包括淺表性泌豆、結(jié)節(jié)性和浸潤性 BCC（ID：BCC-I定庵；k = 9,837 個細(xì)胞）； 淺表和結(jié)節(jié)性 BCC（ID：BCC-II踪危；k = 11,724 個細(xì)胞）蔬浙； 未知/“混合” BCC（ID：BCC-III；k = 6,712 個細(xì)胞）贞远； 和浸潤性神經(jīng)周圍浸潤 BCC（ID：BCC-IV畴博；k = 8,569 個細(xì)胞）。 PTS 組織構(gòu)成與 BCC 病變直接相鄰的皮膚蓝仲。 我們總共處理了 56,162 個原始單細(xì)胞（k_PTS = 17,727 與 k_BCC = 38,435）俱病。 Following putative doublet/multiplet removal and quality control filtering of individual libraries。

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剩余 52,966 個“有效”細(xì)胞（k_PTS = 16,903 與 k_BCC = 37,667）袱结。 為了解決單個腫瘤中存在的細(xì)胞多樣性并進(jìn)行下游查詢和比較基因表達(dá)分析亮隙，處理和表征了單個 BCC，并使用 Seurat 并可視化推斷的推定細(xì)胞類型垢夹。 確定了十種大的細(xì)胞類型溢吻，包括 MKI67⁺ 增殖性上皮細(xì)胞、KRT14⁺ 基底上皮/腫瘤細(xì)胞果元、終末分化的 IVL⁺ 角質(zhì)形成細(xì)胞促王、AZPG⁺ 附屬相關(guān)細(xì)胞、PDGFRA⁺ 成纖維細(xì)胞而晒、RGS5⁺ 成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞蝇狼、TIE1⁺ 內(nèi)皮細(xì)胞、PROX1⁺ 內(nèi)皮細(xì)胞欣硼、MLANA⁺ 黑素細(xì)胞和通過 PTPRC 表達(dá)鑒定的免疫細(xì)胞题翰。沒能鑒定具有富含棘層角質(zhì)形成細(xì)胞或Schwann/neural-like細(xì)胞的基因表達(dá)特征的細(xì)胞cluster恶阴。

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為了識別原發(fā) BCC 樣本中存在的假定惡性腫瘤細(xì)胞，我們對 KRT14⁺ 上皮/腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了 InferCNV 分析（關(guān)于inferCNV分析豹障，大家可以參考我的文章10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）腫瘤數(shù)據(jù)分析之腫瘤進(jìn)化（inferCNV+UPhyloplot2））冯事。在 BCC-I、BCC-II 和 BCC-IV 供體的 KRT14⁺ 上皮細(xì)胞中觀察到與染色體重復(fù)（深紅色）和缺失（深藍(lán)色）相關(guān)的異逞基因組譜昵仅，與其對應(yīng)的非上皮、非-免疫內(nèi)參細(xì)胞累魔。有趣的是摔笤，與其他 BCC 亞型相比，BCC-III 沒有顯示出顯著的異晨研矗基因組結(jié)構(gòu)變化吕世。相反，它的特征更類似于 PTS 樣品中存在的非附屬物 KRT14⁺ 上皮細(xì)胞梯投，表明某些腫瘤沒有顯著的拷貝數(shù)變異驅(qū)動腫瘤生長命辖。盡管 InferCNV 推斷出 KRT14⁺ 上皮細(xì)胞的異常基因組變化分蓖，但它無法識別單個惡性細(xì)胞尔艇。即使使用非上皮細(xì)胞作為參考，我們也無法使用 copyKAT（關(guān)于copycat么鹤，大家可以參考我之前的文章copyKAT推斷單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組腫瘤細(xì)胞CNV（自動識別腫瘤normal和tumor）） 準(zhǔn)確地識別單個惡性細(xì)胞终娃。

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當(dāng)使用 Seurat 整合 BCC 和 PTS 數(shù)據(jù)集時，我們注意到來自 PTS 的 BCC KRT14⁺ 上皮/腫瘤細(xì)胞的獨立聚類蒸甜，以及進(jìn)一步的 BCC 間分區(qū)棠耕。與 KRT14⁺ 上皮/腫瘤細(xì)胞不同，所有其他非上皮細(xì)胞類型不會相互獨立地drift或聚集迅皇，無論供體如何昧辽。高 BCC 腫瘤異質(zhì)性與其他報告一致衙熔，這些報告表明其他人類癌癥（包括黑色素瘤和鱗狀細(xì)胞癌）中存在高度轉(zhuǎn)錄組驅(qū)動的上皮登颓、腫瘤間異質(zhì)性。為了確定識別與 PTS 顯著不同的 BCC 相關(guān) KRT14⁺ 上皮/腫瘤細(xì)胞狀態(tài)的最佳方法红氯，將基于 Seurat 的整合與四種不同但廣泛流行的方法進(jìn)行了比較框咙，包括 SCTransform、LIGER（關(guān)于LIGER痢甘，大家可以參考我的文章10X單細(xì)胞（空間轉(zhuǎn)錄組）數(shù)據(jù)整合分析批次矯正之liger）喇嘱、Harmony（關(guān)于harmony，大家可以參考我的文章10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）整合分析批次處理之細(xì)節(jié)（harmony）） 和 scMC塞栅。無論條件或供體如何者铜，所有算法都將非上皮細(xì)胞聚集在一起。然而，Seurat作烟、SCTransform愉粤、LIGER 和 Harmony 模糊地聚集上皮細(xì)胞，無論條件或供體如何拿撩；而與 Seurat 的聚類完全由供體驅(qū)動衣厘，因此很難識別和解釋 BCC 特異性上皮細(xì)胞類型或狀態(tài)。形成鮮明對比的是压恒，scMC 明顯地將 BCC 和 PTS 上皮細(xì)胞聚集在一起影暴，同時保持轉(zhuǎn)錄相似細(xì)胞類型的聚集。由于 scMC 保留了生物變異探赫，同時去除了與每個樣本相關(guān)的技術(shù)變異型宙，因此將得到的 scMC 校正的 BCC-PTS 數(shù)據(jù)用于下游查詢和比較分析。(大家做分析的時候伦吠，整合分析也要多方法比較)

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scMC 保持了與 Seurat 的獨立 BCC 聚類所發(fā)現(xiàn)的相同的十種不同的細(xì)胞類型早歇。 按條件和供體劃分的每種大類細(xì)胞類型的量化揭示了 BCC 和 PTS 之間的相對細(xì)胞類型頻率相似性。 非 PTS KRT14⁺ 上皮/腫瘤細(xì)胞獨特地表達(dá)已知的 BCC 相關(guān)基因生物標(biāo)志物讨勤，包括 BCAM 和 EPCAM箭跳。 有趣的是，來自 BCC-III 的 KRT14⁺上皮/腫瘤細(xì)胞顯示出“混合”位置潭千，其中許多細(xì)胞與 PTS 樣本顯著重疊谱姓，而其他細(xì)胞則獨特地單獨聚集，這與我們之前的觀察結(jié)果與 InferCNV 分析相匹配刨晴。 總之屉来，分析的基準(zhǔn)方法和比較 scRNA-seq 聚類分析解決了人類 BCC 的不同細(xì)胞lanscope，并揭示了與 PTS 相比的主要 KRT14⁺ 上皮細(xì)胞類型差異狈癞，表明人類 BCC 樣本之間存在高度的腫瘤間和腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性 .

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Defining normal versus malignant epithelial cells.

為了定義人類 BCC 和 PTS 樣本的上皮/腫瘤細(xì)胞圖譜茄靠，對 30,058 個 KRT14⁺ 上皮衍生細(xì)胞進(jìn)行了再分群（k_PTS = 5,146 與 k_BCC = 24,872）并確定了 15 個上皮細(xì)胞clusters，所有這些細(xì)胞clusters都由獨特的表達(dá)定義基因生物標(biāo)志物蝶桶。三個亞群 (IFE I-III) 似乎是正常的上皮細(xì)胞慨绳，幾乎構(gòu)成了所有 PTS 樣本和一小部分 BCC 樣本，而其余細(xì)胞僅聚集到 BCC 相關(guān)樣本 (BAS I-十二）真竖。綜合比較分析沒有揭示獨特的腫瘤特異性角質(zhì)形成細(xì)胞 (TSK) 的存在脐雪，正如之前報道的鱗狀細(xì)胞癌，而是具有共同和獨特基因表達(dá)模式的 BCC 相關(guān)角質(zhì)形成細(xì)胞恢共。為了探索它們的基因表達(dá)譜和空間結(jié)構(gòu)战秋，在空間上解析了選定的基因產(chǎn)物，包括 KRT15 (BAS-II)讨韭、LHX2 (BAS-IV) 和 ACTA2 (BAS-XI)脂信。 KRT15標(biāo)記了KRT14^high腫瘤巢的一個subsets癣蟋，LHX2標(biāo)記了KRT14^high腫瘤巢外周的細(xì)胞核，ACTA2標(biāo)記了KRT14^low腫瘤巢的外周狰闪，加強了BCC腫瘤的異質(zhì)性梢薪。

接下來，通過使用先前定義的 BCC 相關(guān)基因表達(dá)譜（包括 EPCAM尝哆、BCAM 和 TP63 的共表達(dá)）對單個 KRT14⁺ 細(xì)胞進(jìn)行評分來確定“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞的身份秉撇。當(dāng)按條件分組并量化時，觀察到大多數(shù) BCC 相關(guān)細(xì)胞表達(dá)了這些標(biāo)記中的一些秋泄，但不是全部三個琐馆。有趣的是，EPCAM 和 BCAM 是 BCC 特有的恒序，而 TP63 在 PTS 樣本中的表達(dá)很低瘦麸。為了開發(fā)更好的轉(zhuǎn)化措施，確定了 BCC 和 PTS 上皮細(xì)胞之間顯著的基因表達(dá)差異歧胁。這種方法導(dǎo)致將 LGALS1 鑒定為在 BCC 上皮細(xì)胞中高度上調(diào)的基因滋饲。 LGALS1 以前與胰腺導(dǎo)管腺癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌喊巍、宮頸癌和惡性黑色素瘤有關(guān)屠缭。分析采用了類似的方法來鑒定與我們的供體隊列中不同 BCC 樣本相關(guān)的基因。確定 MYLK崭参、CALM5呵曹、SCGB2A2 和 KRT19 在每個腫瘤樣本中高度表達(dá)。

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使用 scRNA-seq 數(shù)據(jù)來確定是否可以將基因組研究的其他bulk轉(zhuǎn)錄組中鑒定的基因或基因特異性位點與 BCC 宏觀環(huán)境中的單個細(xì)胞相匹配何暮。 為此奄喂，分析使用了人類 BCC scRNA-seq 數(shù)據(jù)和通過 BCC 中的 GWAS 研究確定的 BCC 風(fēng)險位點的重疊表達(dá)。 成功鑒定了幾個與特定 BCC 風(fēng)險位點相關(guān)且僅在 BCC 上皮細(xì)胞中表達(dá)的差異表達(dá)基因海洼，包括 BNC2跨新、CUX1、ZBTB10 和 CASC15坏逢。

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RNA dynamics show de-differentiation in BCC.

由于 BCC 顯示出腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性，我們使用單細(xì)胞Velocyto (scVelo)（關(guān)于scvelo秽晚，大家可以參考我的文章10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）scvelo動態(tài)模型導(dǎo)論） 進(jìn)行了 RNA 速度分析瓦糟，以更好地估計和概括 KRT14⁺ 上皮細(xì)胞內(nèi)的瞬時細(xì)胞狀態(tài)。將 RNA 速度向量與 Markovnikov 根和終端狀態(tài)耦合表明表面和結(jié)節(jié) (BCC-I)赴蝇；淺表性菩浙、結(jié)節(jié)性和浸潤性（BCC-II）；未知/“混合”亞型 BCC (BCC-III) 表明速度向量指向與高水平的 BCC 相關(guān)特征基因相關(guān)的終末狀態(tài)句伶，以及高水平的 HH 和 WNT 通路基因劲蜻。相比之下，神經(jīng)周圍浸潤 BCC (BCC-IV) 的浸潤表現(xiàn)出指向遠(yuǎn)離 HH 基因高區(qū)域的載體考余。有趣的是先嬉，來自 BCC-I 和 BCC-II 中具有明顯高晚期分化基因特征的細(xì)胞的速度表明晚期分化上皮細(xì)胞的潛在去分化命運選擇有利于 BCC 中更基礎(chǔ)的命運，與正常上皮細(xì)胞顯示出向高晚期分化基因特征的速度.

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Fibroblast heterogeneity and function in human BCC.

最近的研究已經(jīng)確定了人類和小鼠皮膚組織中不同狀態(tài)和條件的成纖維細(xì)胞 (FIB) 和成纖維細(xì)胞樣 (FIB-like) 細(xì)胞的大量功能異質(zhì)性楚堤，在體內(nèi)平衡疫蔓、損傷介導(dǎo)的修復(fù)和再生方面,疾病和癌癥等具有重要的生物學(xué)相關(guān)性。 為了辨別人類 BCC 和 PTS 區(qū)域中是否存在細(xì)胞和空間 FIB 或 FIB 樣異質(zhì)性身冬，根據(jù) PDGFRA 和 RGS5 的表達(dá)對 FIB 和 FIB 樣細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)分衅胀，總共產(chǎn)生了 7,080 個細(xì)胞（k_PTS = 1305 vs k_BCC = 5,775）。 兩種細(xì)胞類型的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 DCN 和 LUM 都呈陽性酥筝。 這種子聚類方法導(dǎo)致識別出四個 FIB populations和兩個類似 FIB 的populations拗小，所有這些populations都由獨特基因生物標(biāo)志物的差異表達(dá)定義。

為了探索它們在人類 BCC 中的基因表達(dá)譜和空間結(jié)構(gòu)樱哼，使用蛋白質(zhì)免疫染色結(jié)合高分辨率共聚焦成像在空間上解析了它們的原位分布哀九。cluster 1 成纖維細(xì)胞 (FIB I) 占分析的所有 FIB 的約 8%，并共同表達(dá) ASPN搅幅。已顯示 ASPN 過表達(dá)導(dǎo)致癌癥進(jìn)展和增強轉(zhuǎn)移阅束，其在間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中的表達(dá)相似。在原位茄唐，ASPN⁺ FIB 無處不在地出現(xiàn)在整個真皮中息裸。cluster 2 FIB (FIB II) 占所有 FIB 的約 8%，共同表達(dá) CLIC2沪编。在原位呼盆，CLIC2⁺ FIB 稀疏地位于 KRT14⁺ 腫瘤細(xì)胞巢周圍。cluster 3 FIB (FIB III) 占所有 FIB 的約 32%蚁廓，共同表達(dá) CEMIP访圃。在結(jié)直腸癌中，黏膜下層上皮細(xì)胞中缺氧介導(dǎo)的 CEMIP 過度表達(dá)導(dǎo)致最終增強的細(xì)胞遷移狀態(tài)相嵌。此外腿时，CEMIP⁺ FIB 圍繞 KRT14⁺ 腫瘤細(xì)胞巢况脆。最后，cluster 4 FIBs (FIB IV) 占所有 FIBs 的約 28% 并穩(wěn)健地表達(dá) TMEM119批糟。 TMEM119 在骨肉瘤細(xì)胞中上調(diào)格了，其過表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期徽鼎、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)盛末。大多數(shù) TMEM119⁺ FIB 出現(xiàn)在外周并與 KRT14⁺ 腫瘤巢并列，其程度大于觀察到的 CLIC2⁺ 和 CEMPI⁺ FIB 或無處不在的 ASPN⁺ FIB否淤。還鑒定了兩種類型的 RGS5⁺ FIB 樣細(xì)胞表達(dá) ACTA2（~3%）和 NEU4（~21%）悄但。對來自按條件劃分的每個假定 FIB 和 FIB 樣亞型的細(xì)胞進(jìn)行量化顯示，BCC 和 PTS 樣本中的細(xì)胞類型頻率相似叹括，但 TMEM119⁺ FIB 除外算墨，與 PTS 相比，TMEM119⁺ FIB 在 BCC 中似乎略有擴(kuò)大汁雷。原位成像分析表明净嘀，TMEM119⁺ FIB 在位置和密度方面在 KRT14⁺ 腫瘤巢中明顯分離，進(jìn)一步強化了人類 BCC 中存在顯著的腫瘤間成纖維細(xì)胞異質(zhì)性的概念侠讯，并且該特定群體可能在功能和結(jié)構(gòu)上定位于支持腫瘤生長和進(jìn)展挖藏。

然后檢查了編碼 ECM 相關(guān)蛋白的基因，并比較了它們在不同條件下的表達(dá)譜厢漩，以確定與 PTS 相比 BCC 中 ECM 重塑的水平膜眠。 總的來說，分析確定了編碼各種膠原蛋白的基因的范圍和表達(dá)的顯著變化溜嗜，包括 COL1A1宵膨、COL1A2、COL3A1炸宵、COL4A1辟躏、COL4A2、COL5A1土全、COL5A2捎琐、COL5A3、COL6A1裹匙、COL6A2瑞凑、COL6A3、COL8A1概页、COL11A1籽御、COL11A、 COL16A1。 與膠原蛋白編碼基因類似篱蝇，與 PTS 基質(zhì)相比贺待，其他 ECM 相關(guān)蛋白編碼基因徽曲，包括 FN1零截、SPARC、TIMP1秃臣、TIMP2涧衙、MMP2、MMP9奥此、MMP10 和 MMP12弧哎，也在 BCC 中富集。 這些 ECM 相關(guān)編碼基因的表達(dá)不限于單個 FIB 子集稚虎，而是代表泛 BCC ECM 相關(guān)重塑基因譜撤嫩。 這種比較分析表明，與 PTS 相比蠢终，BCC 中的 ECM 相關(guān)重塑有很大程度序攘，這可能是由膠原蛋白和金屬蛋白酶編碼基因的表達(dá)驅(qū)動的。

Rewiring fibroblasts to a reactive stroma state.

因為 TMEM119⁺ FIB 在 KRT14⁺ 腫瘤巢中明顯分離寻拂，并且在 BCC 樣本中的比例顯著更高程奠，所以想知道它們是否可能具有獨特的基因表達(dá)譜，可以在功能上支持腫瘤的生長和進(jìn)展祭钉。為了闡明這一觀點瞄沙，使用專為單細(xì)胞分析量身定制的 DEseq2 的修改版本，對跨 BCC 和 PTS 條件的第 4 cluster FIB 進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析慌核。該分析導(dǎo)致鑒定了在 PTS cluster 4 FIB 中差異上調(diào)的 16 個基因距境，以及在 BCC cluster 4 TMEM119⁺ FIB 中差異上調(diào)的 50 個基因。一種特定基因 WNT5A 在 BCC 中過表達(dá)并與 TMEM119 表達(dá)共定位垮卓。 WNT5A 已成為參與癌癥進(jìn)展的重要分子垫桂，最近的研究表明 WNT5A 調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移扒接、代謝和炎癥伪货。因此，分析的結(jié)果表明 TMEM119⁺ FIB 與 KRT14⁺ 腫瘤細(xì)胞的潛在功能性信號網(wǎng)絡(luò)是通過旁分泌非規(guī)范 WNT 信號驅(qū)動的钾怔。

為了確定可能在不同 FIB 群體（包括 TMEM119⁺ FIB）中驅(qū)動條件特異性基因表達(dá)變化的 BCC 特異性基因調(diào)節(jié)因子（調(diào)節(jié)子）碱呼，我們使用 pySCENIC 進(jìn)行了基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò) (GRN) 分析，并確定了對 BCC 中的每個 FIB/FIB 類clusters宗侦，但不是 PTS愚臀。 TMEM119⁺ FIB 中活躍的前五個調(diào)節(jié)子包括 ATF6B^REG(+)、ETV1^REG(+)矾利、STAT1^REG(+)姑裂、STAT2^REG(+) 和 THAP11^REG(+)馋袜。 發(fā)現(xiàn)該調(diào)節(jié)在所有分析的調(diào)節(jié)子中都是獨一無二的。 單細(xì)胞 GRN 分析表明舶斧，在 FIB 和 FIB 樣細(xì)胞中存在活躍的特定調(diào)節(jié)子欣鳖，并且它們在 BCC 和 PTS 之間特定目標(biāo)的活性和調(diào)節(jié)方面存在顯著差異。 此外茴厉，還發(fā)現(xiàn) STAT1^REG(+) 調(diào)節(jié)子可能參與非規(guī)范 WNT 配體 WNT5A 的上游調(diào)節(jié)泽台。

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基質(zhì)分析確定了人類 BCC 和 PTS 在基因表達(dá)和調(diào)節(jié)子水平上的大量細(xì)胞 FIB 和 FIB 樣異質(zhì)性。為了確定這些細(xì)胞是否存在于連續(xù)體中或具有不同的細(xì)胞狀態(tài)矾缓，我們使用 CEE 計算了 BCC 和 PTS FIB/FIB 樣細(xì)胞的細(xì)胞熵（ξ - 與細(xì)胞轉(zhuǎn)變相關(guān)的能量）（這個地方值得關(guān)注一下）怀酷，并在 Waddington landscope上可視化了它們的個體 CEE 分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明嗜闻，BCC FIB populations的總體熵低于 PTS 的總體熵蜕依，并且 TMEM119⁺ FIB 顯示出最穩(wěn)定的穩(wěn)定性，這表明 FIB I-III 可能顯示出更高的可能性過渡到那些與 BCC 腫瘤巢最并列的 FIB（FIB IV ）琉雳。通過無偏偽時間和 RNA 動力學(xué)耦合分析來跟進(jìn)我們的分析样眠。這些互補的方法揭示了 BCC 和 PTS 之間的兩條主要但截然不同的軌跡。僅關(guān)注 FIB 細(xì)胞咐吼，PTS FIB 從共同的 CEMIP⁺ FIB 起源向 WNT5A⁺ 或 ASPN⁺ 末端分叉吹缔。與此形成鮮明對比的是，BCC FIB 遵循單邊軌跡锯茄，從 ASPN⁺ FIB 發(fā)出并在 TMEM119⁺ FIB 中達(dá)到頂峰厢塘。這些觀察結(jié)果表明，發(fā)生了腫瘤基質(zhì)的“重新分布”以將 FIB 推向 TMEM119⁺/WNT5A⁺ 狀態(tài)以支持腫瘤生長肌幽。

為了識別參與獲取 TMEM119⁺/WNT5A⁺ 狀態(tài)的候選轉(zhuǎn)錄因子 (TF)晚碾，提取了該軌跡中表示的 FIB，將它們與 Monocle2 以假時間樹對齊喂急，并執(zhí)行 scEpath 分析以識別重要的格嘁、假時間依賴的 TF。我們在 PTS（??? PTS廊移，軌跡 1）和 BCC 中的 225 個 TF（??? BCC糕簿，軌跡 1）沿軌跡 1共鑒定了 69 個偽時間依賴性差異表達(dá)的 TF。通過將 TF 分成顯示平均 TF 動態(tài)的組來比較和對比來自兩個軌跡的 TF狡孔，這導(dǎo)致識別出 BCC 軌跡中唯一存在的幾個基因懂诗。有趣的是，與 TMEM119⁺ FIB 的 PTS 相比苗膝，STAT1 以及在較小程度上 TBX15 和 ATF7 在 BCC 的軌跡后期表現(xiàn)出偽依賴性表達(dá)殃恒。其他 TF 顯示出早期的偽依賴軌跡，并在 TMEM119⁺ FIB 中被關(guān)閉，例如 BCC 中的 FOSB 和 PTS 中的 NFKB1离唐。為了更廣泛地了解這些 TF 并確定每個軌跡compartment中的主要通路病附，對偽時間依賴性 TF 進(jìn)行了基因 (GO) 分析。其中亥鬓，發(fā)現(xiàn)與 TGF-β 和炎癥相關(guān)的通路顯著表達(dá)完沪。將這些 GO terms作為生物標(biāo)志物評分疊加到二維嵌入上，以確定它們的表達(dá)是否與腫瘤基質(zhì)的重新分布密切相關(guān)贮竟，并疊加了 RNA 速度流以可視化和匹配細(xì)胞與其相應(yīng)的 GO 的運動丽焊。有趣的是较剃，在達(dá)到由 ncWNT 信號活性 FIB 組成的最終反應(yīng)性基質(zhì)狀態(tài)之前咕别，ASPN⁺ FIB 似乎在 BCC 中經(jīng)歷了 TGF-β⁺ 炎癥狀態(tài)，而不是 PTS拆檬，這是一個 WNT5A 配體含量高的區(qū)域悼院。這些結(jié)果表明仪吧，ASPN⁺ FIB 在 BCC 中發(fā)炎，并且基質(zhì)的重新布線可能由炎癥引起偿短，這可能是由于在 BCC 進(jìn)展過程中與侵入真皮的免疫細(xì)胞發(fā)生了串?dāng)_。

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Inflammatory signaling pathways are highly active in BCC.

FIB 狀態(tài)變化如何影響 BCC 腫瘤生長尚不清楚馋没。為了確定 BCC 和 PTS 微環(huán)境之間的信號差異昔逗，我們通過使用 CellChat（關(guān)于Cellchat，大家可以參考我的文章10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）通訊分析之CellChat篷朵、10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）通訊分析CellChat之多樣本通訊差異分析） 對 KRT14⁺ 上皮/腫瘤和 FIB/FIB 樣細(xì)胞之間的單細(xì)胞-細(xì)胞相互作用進(jìn)行建模來探測人類 BCC FIB-上皮相互作用組勾怒。分析確定了 21 條在基質(zhì)-上皮軸中活躍的重要信號通路，包括 CXCL声旺、IFN-I笔链、IL6、ncWNT 和 TNF腮猖。盡管大多數(shù)通路在 PTS 和 BCC 中均顯示出活性鉴扫，但 GRN 和 MIF 通路在 BCC 中不活躍，而 IGF澈缺、NT 和 TNF 通路在 PTS 中不活躍坪创。然后，通過比較細(xì)胞-細(xì)胞組的通信概率姐赡，確定了 BCC 和 PTS 之間差異調(diào)節(jié)的信號通路配體和受體莱预。不出所料，與 PTS 相比雏吭，這種方法顯示 ncWNT 作為 BCC 中高度活躍的主要信號通路锁施。 ncWNT 信號的相對貢獻(xiàn)主要來自 WNT5A 配體到卷曲受體。與 BCC 相比，WNT5A 配體在 PTS FIB 中的表達(dá)最小且不顯著悉抵。與此形成鮮明對比的是肩狂，ncWNT 信號在 BCC 中非常活躍姥饰，主要由 WNT5A 配體驅(qū)動到卷曲受體 FZD6傻谁、FZD7 和 FZD10。大部分活動都包含在 BAS 細(xì)胞群中列粪，如發(fā)送方和接收方的網(wǎng)絡(luò)中心性分析所示审磁。 WNT5A 是促炎反應(yīng)的已知驅(qū)動因素，包括 CXCL岂座、IFN-I态蒂、IL6 和 TNF。 CXCL 信號包含在 PTS 中的 FIB 中费什，但擴(kuò)展到 BCC 中的 BAS 細(xì)胞cluster钾恢； IFN-I 信號包含在 PTS 的上皮細(xì)胞內(nèi)，但在 BCC 中擴(kuò)展到 FIB鸳址；與 PTS 相比瘩蚪，IL6 信號在 BCC 中顯示出更大的串?dāng)_； TNF 信號是 BCC 獨有的稿黍。 TNF 自分泌和旁分泌信號源自 BCC 中的循環(huán)上皮細(xì)胞并向其他上皮細(xì)胞和 FIB 發(fā)出信號疹瘦，并且是 WNT5A 的激活劑⊙睬颍總之言沐，這些結(jié)果表明，急性炎癥信號可能會激活 WNT5A辕漂，從而維持促炎反應(yīng)并作為 BCC 中主要的炎癥和應(yīng)激信號中樞呢灶。

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Heat shock proteins regulate BCC growth.

為了確定 FIB 的促炎反應(yīng)如何影響腫瘤生長，在 BCC 與 PTS 上皮細(xì)胞中尋找相關(guān)的差異表達(dá)基因钉嘹，并在 BCC 中發(fā)現(xiàn)了顯著的熱休克蛋白 (HSP) 特征鸯乃。 HSP 是對細(xì)胞壓力和炎癥的適應(yīng)性反應(yīng)，與癌癥的發(fā)展和進(jìn)展密切相關(guān)跋涣。 我們鑒定了與 PTS 上皮細(xì)胞相比在 BCC 中顯著上調(diào)的五個 HSP 編碼基因缨睡，包括 HSP90AB1、HSP90AA1陈辱、HSPA2奖年、HSPA6、HSPA8沛贪、HSPA12B 和 HSPA1A陋守。 接下來使用 pySCENIC 進(jìn)行 GRN 分析震贵，并確定了幾個可能調(diào)節(jié) HSP 編碼基因的活性調(diào)節(jié)子，包括 ELF1^REG(+)水评、E2F6^REG(+)猩系、EGR1^REG(+)、EGR2^REG(+)中燥、JUN^REG(+)和 YY1^REG(+) . 這些結(jié)果表明寇甸，在分析的不同 BCC 亞型的任何一個cluster中，高比例的 BCC 細(xì)胞對 HSP 基因表達(dá)的評分很高疗涉。

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然后我們使用蛋白質(zhì)免疫染色結(jié)合高分辨率共聚焦成像在空間上解析了 HSP70 的原位表達(dá)拿霉，因為 HSP70 是 HSPA1A 的基因產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn) KRT14⁺ BCC 巢表達(dá)細(xì)胞質(zhì) HSP70咱扣，很少有 IFE 上皮細(xì)胞和非上皮細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)绽淘。有趣的是，具有神經(jīng)周圍浸潤的原發(fā)性浸潤性 BCC 證明了 HSP70 的核表達(dá)偏窝。為了確定 HSP 是否對 BCC 細(xì)胞生長很重要收恢，我們在鼠 BCC 細(xì)胞系 ASZ001 上使用了 HSP70 抑制劑 Ver155008，并觀察到 ASZ001 細(xì)胞增殖的劑量依賴性抑制祭往，同時伴隨著下游 HH 靶基因 Gli1 表達(dá)的降低。 RNA和蛋白質(zhì)水平火窒。通過 Mki67 和 Casp3 染色定量確定硼补，HSP70 抑制影響 BCC 細(xì)胞的增殖和存活。最后熏矿，旨在使用 BCC 小鼠模型 Gli1-CreERT2 確定 HSP 對體內(nèi) BCC 的作用已骇； Ptch1fl/fl 。我們誘導(dǎo)了 Gli1-Cre^ERT2票编； Ptch1^f1|f1 小鼠連續(xù)三天服用他莫昔芬以產(chǎn)生基底細(xì)胞樣微腫瘤褪储，然后每天腹腔注射載體對照或 Ver155008，持續(xù) 7 天慧域。 Ver155008 處理的小鼠背部皮膚的組織學(xué)染色顯示鲤竹，與載體處理的對照相比，微腫瘤面積顯著減少昔榴，呈劑量依賴性辛藻。我們的體外和體內(nèi)研究有助于協(xié)調(diào)我們的 scRNA-seq 分析并確定 HSP，尤其是 HSP70互订，作為 BCC 腫瘤生長的潛在新調(diào)節(jié)劑吱肌，并可能為 BCC 的治療提供新的治療場所。

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Discussion

人類 BCC 的功能異質(zhì)性主要是通過批量水平的基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究來探索的仰禽，在這些研究中氮墨，很難分離出不同的細(xì)胞類型和腫瘤內(nèi)的克隆性纺蛆。使用單細(xì)胞技術(shù)，我們確定了構(gòu)成 BCC 的細(xì)胞類型和狀態(tài)的環(huán)境规揪，并發(fā)現(xiàn)bulk研究可以提供互補的數(shù)據(jù)集犹撒，但由于活檢樣本中正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的異質(zhì)性。在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析時粒褒，我們發(fā)現(xiàn)了更多的 BCC 生物標(biāo)志物识颊，它們可以更好地定義 BCC 并標(biāo)記來自特定供體的腫瘤，進(jìn)一步突出了這種疾病的異質(zhì)性奕坟。我們還確定了 CAF 的空間異質(zhì)性祥款，導(dǎo)致有利于 TMEM119⁺/WNT5A⁺ 反應(yīng)性基質(zhì)和炎癥信號的軌跡，在 CAF 和 BCC 細(xì)胞cluster之間產(chǎn)生細(xì)胞間串?dāng)_月杉。最后刃跛，我們的結(jié)果表明 BCC 腫瘤通過表達(dá) HSP 對來自基質(zhì)的炎癥信號作出反應(yīng)，并且 HSP 抑制劑可以成為抑制腫瘤生長的有效治療方法苛萎。

我們在活檢樣本之間和內(nèi)部區(qū)分惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞以創(chuàng)建更細(xì)微的 BCC 基因特征的努力強調(diào)了整合基準(zhǔn)的重要性桨昙。盡管沒有算法是完美的，但我們證明了使用幾種不同方法的基準(zhǔn)集成增加了對基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的可信度腌歉。 BCC 具有高度異質(zhì)性蛙酪，并且在所有癌癥中具有最高的突變頻率，因此難以整合多個樣本翘盖。使用的所有四種聚類算法（Seurat桂塞、SCTransform、LIGER馍驯、Harmony 和 scMC）在正確聚類具有低突變負(fù)荷的非上皮細(xì)胞類型方面表現(xiàn)出顯著的效率阁危，但具有較高突變負(fù)荷的上皮細(xì)胞在聚類中表現(xiàn)出顯著的批次效應(yīng)。根據(jù)我們的經(jīng)驗汰瘫，Seurat狂打、SCTransform、LIGER 和 Harmony 無法區(qū)分正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞混弥，Seurat 本身將每個供體彼此分開聚集趴乡，而不管其來源。然而剑逃，scMC 將正常和惡性上皮細(xì)胞清晰地聚集在一起浙宜，同時在每種條件下保持內(nèi)聚力，這可能是因為它能夠?qū)W習(xí)共享的減少維度的細(xì)胞嵌入以保留生物變異蛹磺，同時消除與每個樣本相關(guān)的技術(shù)變異粟瞬。

盡管難以整合上皮細(xì)胞，但基質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)在 PTS 和 BCC 樣本之間顯示出顯著的凝聚力萤捆。在正常和惡性樣本中都發(fā)現(xiàn)了四種 FIB 狀態(tài)和兩種 FIB 樣狀態(tài)裙品，這表明 CAF 可能是正常組織駐留成纖維細(xì)胞的活躍狀態(tài)俗批，并且在 BCC 中不發(fā)生癌癥特異性基質(zhì)狀態(tài)。然而市怎，在 BCC 基質(zhì)中發(fā)生了很大程度的主動重塑岁忘，可能主要由膠原蛋白和金屬蛋白酶基因產(chǎn)物驅(qū)動。此外区匠，RNA 速度分析表明干像，表達(dá) TGF-β 和 IL 基因（CAF 的經(jīng)典激活劑）的高度發(fā)炎基質(zhì)會產(chǎn)生由 WNT5A⁺ FIB 突出顯示的反應(yīng)性基質(zhì)。在到達(dá) TMEM119⁺/WNT5A⁺ 之前驰弄，基質(zhì)的這種癌癥特異性重新布線從在整個基質(zhì)中無處不在的 ASPN⁺ 狀態(tài) (FIB I) 轉(zhuǎn)變?yōu)樵?KRT14⁺ 腫瘤巢周圍很少發(fā)現(xiàn)的 CLIC2+ (FIB II) 和 CEMIP+ (FIB III) 狀態(tài)與其他三種 FIB 狀態(tài)相比麻汰，以相對較高的密度圍繞 KRT14⁺ 腫瘤巢的狀態(tài)（FIB IV）。 TGFB1 和一般炎癥基因在前三個 FIB 群體中表達(dá)戚篙，并且可能提供激活 WNT5A⁺ 狀態(tài)的機制五鲫，而 WNT5A 可能會加強這種信號傳導(dǎo)，因為它是誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的促炎信號的已知驅(qū)動因素岔擂。炎癥和 CAF 驅(qū)動的基質(zhì)重新布線是有希望的治療靶點位喂，我們的 GRN 分析表明 JAK-STAT 通路可能調(diào)節(jié) WNT5A 表達(dá)，為 JAK-STAT 抑制劑治療 BCC 患者開辟了可能性.

CAFs 和一般 FIB 炎癥如何影響 BCC 腫瘤生長尚不清楚乱灵。我們的 CellChat 推斷信號結(jié)果表明 FIB 和 BAS cluster之間的信號"爆發(fā)"塑崖，涉及 TNF、IL6阔蛉、IFN-1 和 CXCL 通路弃舒。有趣的是，WNT5A 是這些途徑中的每一個的已知驅(qū)動因素状原，TGFB1 和炎癥信號（如 IL6 和 TNF）是已知的 CAF 和 WNT5A 激活劑，尤其是 WNT5A苗踪。隨著炎癥信號的涌入颠区，BCC 似乎通過上調(diào) HSP 作為一種保護(hù)機制來做出反應(yīng)。眾所周知通铲，HSP 在 DNA 修復(fù)機制中發(fā)揮重要作用毕莱，以維持基因組的穩(wěn)定性和完整性，這一過程與炎癥密切相關(guān)颅夺。癌癥生活在一把雙刃劍上朋截，它們需要足夠的基因組不穩(wěn)定性才能茁壯成長，但又不能有太多的不穩(wěn)定性來不利地改變成功的復(fù)制吧黄。癌癥特異性 HSP 表達(dá)可能有助于維持基因組不穩(wěn)定性平衡以促進(jìn)腫瘤生長部服，這可以解釋我們的結(jié)果表明 HSP 抑制劑可有效抑制 BCC 生長。正在進(jìn)行的癌癥類型臨床試驗證明拗慨，聯(lián)合治療可能更有效地抑制 HSP廓八，這是未來可能的方向.

Overall, our findings illustrate the heterogeneity and dynamic nature of the BCC cellular ecosystem. The signaling relationships between BCC epithelial cells and fibroblasts revealed a WNT5A-inflammatory signature that led to the discovery of a HSP70-specific protective mechanism that is necessary to maintain tumor growth. Further characterizing these types of responses may provide additional mechanistic insight into the complicated crosstalk between the tumor and its microenvironment and provide additional avenues for therapeutic suppression of cancer.

Methods

Copy number variation analysis.

To infer genomic copy number structure, we performed InferCNV (version 1.7.1) as per developer’s suggestions using standard parameters (https://github.com/broadinstitute/inferCNV/wiki). We used a cutoff of 0.1 for the minimum average read counts per gene among reference cells. We used non-immune, non-epithelial, and non-appendage epithelial cells as internal reference control.

Marker gene module scoring.

Aggregate marker gene module scores were assigned to early epithelial differentiation, late epithelial differentiation, and BCC identity score using the AddModuleScore function in Seurat with the following conditions enabled: ctrl = 2.5 or 5. Basal, non-differentiating and basal late differentiating epithelial cells were identified by implementation of a “Early differentiation” and “Late differentiation” signatures defined by a core set of known markers as previously described. BCC cells were identified by implementation of a BCC signature defined by a core set of known markers as previously described. Hedhehog- and WNT-active and responsive cells were identified by implementation of a “Hedgehog signaling aggregate score” or “WNT signaling aggregate score” defined by a core set of known HH and WNT ligands and receptors, respectively as previously described in GSEA. Hedhehog and WNT-active/responsive cells were colored distinctly. Double-positive cells were color-coded based on a blend threshold score. Aggregate marker gene module and blend threshold scores were Log-normalized and visualized in two-dimensional feature plots.

RNA dynamics analysis.

To calculate RNA dynamics in single cells we performed RNA velocity analysis. First, we generated loom files using the Python script velocyto.py (Python version 2.7.2) for each individual library. Loom files for individual libraries from a particular condition (normal or tumor skin) were combined using loompy (version 2.0.16). Velocity vectors were estimated using scVelo (version 0.2.2) based on the linear or dynamic model of RNA velocity with default parameters. Velocity vectors were overlaid on a two-dimensional embedding. Predicted root and terminal states based on Markovnikov reaction diffusion were calculated. Root and terminal states were visualized on a two-dimensional embedding.(SCvelo)

Pseudotime analyses.

Pseudo-ordering of individual fibroblasts (FIBs) from peri-tumor skin (PTS) or basal cell carcinoma (BCC) was performed using Monocle2 (Version 2.10.1). Briefly, FIB cells from PTS or BCC trajectory 1 were subclustered and a cellDataSet object was created in Monocle2 with the function newCellDataSet with the following arguments enabled: lowerDetectionLimit = 1.0, expressionFamily = negbinomial.size(). Subclustered FIBs were ordered based on variable features and DDRTree-based dimensionality reduction was performed using the reduceDimensions function. To identify differentially expressed pseudotime-dependent transcription factor changes, we applied single cell Energy path (scEpath; Version 1; MATLAB Version 9.5) on Monocle2-ordered PTS or BCC FIBs. Statistically significant pseudotime-dependent gene changes were identified by comparing the standard deviation of the observed smoothed expressions with a set of similarly permuted expressions by randomly permuting the cell order (nboot = 100 permutations). We considered all genes with a standard deviation greater than 0.01 and a Bonferroni-corrected P-value below a significance level α = 0.05 to be pseudotime-dependent. Human transcription factors were identified using the Animal Transcription Factor Database (AnimalTFDB 2.0) by enabling the TF_Ifo.human.Symbol function. Pseudotime-dependent genes were represented and visualized using a rolling wave plot with user-defined optimal K-means clustering.

Cell-cell communication analysis

使用 CellChat基于大量配體-受體對轉(zhuǎn)錄物對細(xì)胞-細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行建模奉芦。為了推斷相鄰細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)差異和相似性，我們從個體條件下對上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行了subcluster剧蹂。感興趣的細(xì)胞組被合并声功、標(biāo)準(zhǔn)化并用作 CellChat 的輸入。我們分別用identifyOverExpressedGenes (thresh.p = 0.05) 和identifyOverExpressedInteractions 函數(shù)計算了過度表達(dá)的基因和顯著的配體-受體相互作用宠叼。我們使用了 CellChat 提供的配體-受體對的人類數(shù)據(jù)庫先巴。使用computeCommunProb 計算通信概率（tresh = 0.05，nboot = 100冒冬，Hill 函數(shù)參數(shù)kn = 0.5）并使用computeCommunProbPathway 和默認(rèn)參數(shù)（tresh = 0.05）推斷信號通路級別的蜂窩通信網(wǎng)絡(luò)伸蚯。我們過濾掉了每組至少有 5 個細(xì)胞的細(xì)胞間通訊。聚合的細(xì)胞 - 細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)是使用默認(rèn)參數(shù)使用aggregateNet (tresh = 0.05) 計算的窄驹。為了識別相鄰和腫瘤數(shù)據(jù)集中的保守和誘導(dǎo)/擾動通信網(wǎng)絡(luò)朝卒，我們進(jìn)行了聯(lián)合流形和分類學(xué)習(xí)分析。

Gene Regulatory Network analysis.

基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在 Python 環(huán)境（3.7 版）中使用 pySCENIC（0.10.2 版）建模乐埠。我們使用了預(yù)先定義的人類轉(zhuǎn)錄因子 (TF) 列表 (https://github.com/aertslab/pySCENIC/blob/master/resources/hs_hgnc_tfs.txt) 并通過 GRNBoost2 推斷它們與其推定的目標(biāo)基因之間的調(diào)節(jié)相互作用.我們專注于激活模塊并將它們用于下游查詢抗斤。我們基于來自 TSS (hg38__refseq-r80__10kb_up_and_down_tss.mc9nr.feather) (https://resources.aertslab.org/cistarget/) 的 10kb 假定調(diào)控區(qū)域邊界的排序和恢復(fù)方法進(jìn)行了 cisTarget 基序富集。 AUC 指標(biāo)用于評估基因恢復(fù)和調(diào)節(jié)子活性丈咐，并用于降維瑞眼。如前所述，通過將調(diào)節(jié)子特異性分?jǐn)?shù) (RSS) 轉(zhuǎn)換為 Z 分?jǐn)?shù)棵逊，將調(diào)節(jié)子在成纖維細(xì)胞/成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞中的活性相互比較伤疙，并在不同條件下進(jìn)行比較。使用 iRegulon (http://iregulon.aertslab.org) 從網(wǎng)絡(luò)推理輸出中識別特定于 Regulon 的模塊辆影。 Regulon 目標(biāo)與不同條件下特定cluster中差異表達(dá)的基因相關(guān)徒像。

生活很好，有你更好