Nat Biotech | 中科院楊輝組通過(guò)靶向RNA降解的高保真Cas13變體降低副作用
原創(chuàng)?圖靈基因?圖靈基因?2022-09-06 10:10?發(fā)表于江蘇
收錄于合集#前沿分子生物學(xué)機(jī)制
CRISPR–Cas13——一種2類VI型RNA核酸內(nèi)切酶盏浇，具有兩個(gè)高等真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合（HEPN）結(jié)構(gòu)域泼掠，用于RNA切割——靶向并降解RNA按声。RNA靶向已廣泛用于酵母、植物琼懊、果蠅、斑馬魚和哺乳動(dòng)物中的RNA切割。它還被用于檢測(cè)核酸存在的分析跛梗。
現(xiàn)在透绩，研究人員開發(fā)了一種快速靈敏的雙熒光報(bào)告系統(tǒng)翘骂，可以檢測(cè)附帶效應(yīng)。在此過(guò)程中帚豪，他們發(fā)現(xiàn)Cas13可以在HEK293T細(xì)胞中誘導(dǎo)大量的附帶效應(yīng)碳竟。此外，他們使用該系統(tǒng)測(cè)試了新設(shè)計(jì)的變體志鞍，發(fā)現(xiàn)了顯著減少脫靶效應(yīng)的高保真Cas13（hfCas13）變體瞭亮。
這項(xiàng)研究發(fā)表在《Nature Biotechnology》上的一篇題為“High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects”的論文中，證明了hfCas13在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物中幾乎沒有副作用的情況下有效降解靶向RNA的可行性固棚。
人們對(duì)Cas13的脫靶效應(yīng)提出了擔(dān)憂统翩。先前的結(jié)構(gòu)研究表明，當(dāng)Cas13與靶向RNA結(jié)合時(shí)此洲，兩個(gè)HEPN核酸酶結(jié)構(gòu)域可能會(huì)在蛋白質(zhì)表面形成催化位點(diǎn)厂汗，因此除了靶向RNA的靶向切割外，還可能產(chǎn)生旁觀者RNA的混雜切割呜师。
由于這種附帶效應(yīng)娶桦，Cas13可能會(huì)隨機(jī)降解靶向RNA和非靶向RNA，因此難以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和解釋結(jié)果汁汗。
在這項(xiàng)研究中衷畦，研究人員設(shè)計(jì)了一種雙熒光報(bào)告基因（EGFP和mCherry）質(zhì)粒系統(tǒng)，來(lái)檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Cas13的附帶效應(yīng)知牌。在該系統(tǒng)中祈争，mCherry熒光細(xì)胞的丟失被解釋為成功的靶向編輯；EGFP熒光細(xì)胞的丟失被解釋為脫靶切割角寸。在200多個(gè)工程變體中菩混，一些Cas13變體（包括Cas13d和Cas13X）表現(xiàn)出有效的靶向活性忿墅，但附帶活性顯著降低。
然后沮峡，研究人員試圖通過(guò)誘變來(lái)設(shè)計(jì)Cas13d（RfxCas13d疚脐，一種來(lái)自Ruminococcus flavefaciens XPD3002的Cas13d），并基于新的雙熒光報(bào)告系統(tǒng)（包括含有EGFP邢疙、mCherry和EGFP靶向gRNA的單個(gè)質(zhì)粒）篩選副作用最小的變體棍弄。
該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)并生成了一個(gè)Cas13d變異的誘變文庫(kù)，并將其分別轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中秘症。通過(guò)使用流式細(xì)胞術(shù)分析報(bào)告熒光照卦，五種變體（N1V7、N2V7乡摹、N2V8役耕、N3V7?和N15V4）顯示出相對(duì)較低的EGFP+細(xì)胞百分比，以及較高的mCherry+細(xì)胞百分比聪廉，表明靶向活性較高瞬痘，副作用活性降低。
變體N2V8是一種高保真Cas13d（hfCas13d）板熊，由于其對(duì)RNA降解的高度特異性框全，被用于進(jìn)一步表征，包括使用RNA測(cè)序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組范圍的脫靶分析干签。當(dāng)靶向幾種內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物（如PPIA）時(shí)津辩，hfCas13d的脫靶基因數(shù)量顯著減少。此外容劳，hfCas13變體對(duì)細(xì)胞系喘沿、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和體細(xì)胞沒有可檢測(cè)到的附帶損傷，因此支持其體內(nèi)應(yīng)用竭贩。
該團(tuán)隊(duì)于2021年發(fā)現(xiàn)了CRISPR-Cas13X系統(tǒng)蚜印，這是迄今為止已知的最小（只有775個(gè)氨基酸）RNA編輯工具留量。在他們的新研究中窄赋，由中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所Yang Hui博士和HuiGene Therapeutics的研發(fā)團(tuán)隊(duì)領(lǐng)導(dǎo)的研究人員對(duì)Cas13X進(jìn)行了進(jìn)一步改造，并獲得了hfCas13X變體楼熄，該變體在靶向RNA降解方面表現(xiàn)出高特異性忆绰，但副作用最小。hfCas13X在基于RNA編輯的基因治療領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力可岂。本研究中鑒定的Cas13變體在未來(lái)的RNA編輯和治療應(yīng)用中可能會(huì)更加有用错敢。
