在已鑒定的170多種RNA核苷酸堿基的化學(xué)修飾中，RNA甲基化是存在于幾乎所有類(lèi)型RNA上的的主要表觀轉(zhuǎn)錄修飾類(lèi)型伍纫，并已被證明參與RNA代謝的整個(gè)過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄、?pre-mRNA可變剪切和成熟次哈、mRNA出核、mRNA降解和穩(wěn)定吆录、mRNA翻譯窑滞。由于高通量檢測(cè)技術(shù)發(fā)展以及動(dòng)態(tài)調(diào)控因子和識(shí)別蛋白的鑒定，RNA甲基化修飾在調(diào)控生物體正常發(fā)育以及RNA甲基化失調(diào)時(shí)各種疾病發(fā)生和發(fā)育異常的機(jī)制已越來(lái)越清晰。中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所(國(guó)家生物信息中心)楊運(yùn)桂研究員團(tuán)隊(duì)以“Dynamic RNA methylation modifications and their regulatory role in?mammalian development and diseases“為題發(fā)表綜述文章哀卫，特別關(guān)注三種RNA甲基化：N6-甲基胞嘧啶（m6A）巨坊、5-甲基胞嘧啶（m5C）和N7-甲基腺苷（m7G），總結(jié)了這三種RNA修飾與其動(dòng)態(tài)組裝和去除此改、特定結(jié)合蛋白以及高通量檢測(cè)技術(shù)發(fā)展相關(guān)元件趾撵。為全面理解其生物學(xué)意義，還概述了這三種mRNA甲基化修飾在配子發(fā)生共啃、胚胎發(fā)育占调、免疫系統(tǒng)發(fā)育以及疾病和腫瘤進(jìn)展中的基本機(jī)制和關(guān)鍵作用的最新知識(shí)。
mRNA的分布特征和調(diào)控元件
m6A
m6A是研究最廣泛的RNA甲基化修飾類(lèi)型移剪，幾乎存在于所有類(lèi)型的RNA中究珊，包括染色質(zhì)相關(guān)新生pre-mRNA（chromatin-associated nascent pre-mRNA，caRNA）纵苛、成熟mRNA和非編碼RNA（ncRNA）剿涮。約25%哺乳動(dòng)物細(xì)胞mRNA含有m6A，每個(gè)轉(zhuǎn)錄本平均含有三個(gè)m6A殘基攻人。利用LC-MS/MS技術(shù)鑒定出人類(lèi)mRNA中m6A/A占比約0.4%–1.79%取试。m6A主要位于內(nèi)部mRNA中，特別是在靠近終止密碼子和mRNA的3′UTRs區(qū)域贝椿。m6A的保守motif序列是RRACH（R=A/G想括，H=A/C/U）。m6A的分布特征表明m6A可能廣泛參與mRNA代謝烙博，如可變剪切瑟蜈、翻譯等，從而在生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用渣窜。m6A甲基化形成由甲基轉(zhuǎn)移酶（“writers”）催化铺根，主要由METTL3、METTL14和WTAP組成乔宿，以及其他蛋白亞基位迂，包括ZC3H13/Hakai/Virilizer、KIAA1429（VIRMA）详瑞、RBM15/15B掂林。METTL16也是METTL同源家族蛋白之一，催化MAT2A mRNA和U6 snRNA上的m6A形成坝橡。同時(shí)m6A甲基基團(tuán)能夠被去甲基化酶（“erasers”）去除泻帮，主要包括FTO和ALKBH5家族成員。m6A修飾的RNA堿基位點(diǎn)被特定的結(jié)合蛋白（“readers”）識(shí)別以執(zhí)行多樣的生物學(xué)功能计寇。迄今為止已鑒定的m6A readers包括YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（YTHDC1-2锣杂、YTHDF1-3）脂倦、核異質(zhì)核糖核蛋白（HNRNPC、HNRNPA2B1）元莫、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白（IGF2BP1-3）赖阻、真核起始因子3（eIF3）（表1）。
m5C
m5C是另一種常見(jiàn)且豐富的RNA修飾踱蠢，存在于各種RNA中火欧，包括mRNA、tRNA茎截、rRNA和vtRNA布隔。在人類(lèi)和小鼠的mRNA中，m5C位于翻譯起始位點(diǎn)（TSS）的下游區(qū)域稼虎，通過(guò)LC-MS/MS檢測(cè)人類(lèi)mRNA中m5C/C占比約為0.02%–0.09%衅檀。
與m6A類(lèi)似，m5C修飾也由其“writers”和“erasers”動(dòng)態(tài)調(diào)控霎俩。已經(jīng)鑒定的幾個(gè)m5C甲基轉(zhuǎn)移酶（writers）哀军，包括NOL1/NOP2/SUN結(jié)構(gòu)域家族成員（NSUN1-7）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶同源物（DNMT2）和特異性tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員（TRDMT4A和TRDMT4B）打却，其中NSUN2和NSUN6能夠催化mRNA上m5C形成杉适。Tet家族蛋白（TET1和TET2）不僅催化DNA上5mC到5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）的形成，還介導(dǎo)mRNA中m5C氧化柳击。目前猿推，有兩種主要類(lèi)型的mRNA m5C readers蛋白，其具有特殊的RNA結(jié)合域捌肴，以決定m5C修飾RNA分子的不同命運(yùn)蹬叭，包括RNA和出口因子結(jié)合蛋白2（ALYREF）和Y-box結(jié)合蛋白（YBX1和YBX2）（表1）。
m7G
m7G也是一種普遍存在的RNA甲基化修飾状知，被發(fā)現(xiàn)位于真核生物的18S rRNA和tRNA變環(huán)以及microRNA（miRNA）中秽五。此外，大多數(shù)真核mRNA在N7-鳥(niǎo)嘌呤的5′帽端含有m7G修飾饥悴。隨著靈敏度更高的檢測(cè)和定位技術(shù)發(fā)展坦喘，研究人員最近發(fā)現(xiàn)m7G修飾存在于mRNA內(nèi)部區(qū)域。在人類(lèi)和小鼠細(xì)胞系的去帽poly(A)+ mRNA中西设，m7G/G占比約為0.02%–0.05%瓣铣，占相同細(xì)胞中m6A/A的5%–10%（使用LC-MS/MS）。Zhang等人（2019b）報(bào)告稱(chēng)贷揽，m7G峰值主要積聚區(qū)域位于3′UTR棠笑，次要區(qū)域在5′UTR內(nèi)部mRNA中。另一項(xiàng)報(bào)告也發(fā)現(xiàn)擒滑，人類(lèi)和小鼠mRNA內(nèi)部的m7G修飾富集在5′UTR腐晾，特別是在翻譯起始位點(diǎn)附近的AG富集區(qū)域。
與m6A和m5C相比丐一，關(guān)于m7G調(diào)控因子的研究才剛剛開(kāi)始藻糖。報(bào)道的m7G甲基轉(zhuǎn)移酶包括Trm8p/Trm82p復(fù)合體和酵母中的Bud23/Trm112，以及哺乳動(dòng)物中相應(yīng)的同源物METTL1/WDR4和WBSCR22/TRMT112库车，其中METTL1不僅介導(dǎo)tRNA上的m7G修飾巨柒，還催化mRNA內(nèi)部m7G修飾。此外柠衍，RNMT和RAM復(fù)合體參與催化哺乳動(dòng)物N7-鳥(niǎo)嘌呤5′帽端的m7G修飾的形成洋满。最新研究報(bào)告稱(chēng)，QKI（QKI15珍坊、QKI16和QKI17）是mRNA內(nèi)部m7G修飾的第一個(gè)reader蛋白牺勾，它在應(yīng)激條件下與G3BP1互作，抑制m7G修飾的mRNA形成應(yīng)激顆粒阵漏，同時(shí)調(diào)控Hippo信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的穩(wěn)定性和翻譯效率（表1）驻民。
檢測(cè)技術(shù)
基于Bulk RNA甲基化檢測(cè)技術(shù)
基于免疫沉淀方法
抗體和免疫沉淀的RNA甲基化檢測(cè)策略，是一種簡(jiǎn)單履怯、穩(wěn)定且低成本的方法回还，傳統(tǒng)上被廣泛用于各種生物的表觀轉(zhuǎn)錄組特征圖譜繪制。典型的技術(shù)分為兩類(lèi)：基于RNA甲基化抗體的（包括m6A/m5C/m7G-MeRIP-seq叹洲、m6A/m7G-miCLIP-seq柠硕、PA-m6A-seq和m6A-LAIC-seq）和基于甲基轉(zhuǎn)移酶抗體的（m5C-miCLIP-Seq和AZA-IPseq）。
(1) MeRIP-seq
大多數(shù)用于RNA甲基化修飾的高通量測(cè)序技術(shù)依賴(lài)于特定甲基化抗體（如m6A运提、m5C和m7G）蝗柔。甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq），如m6A-MeRIP-Seq（m6A-seq）（圖1A）民泵、m5C-MeRIP-Seq（圖2A）和m7G-MeRIP-Seq（圖3A）是常用的方法诫咱，用于鑒定mRNA中的RNA甲基化peaks。然而洪灯，MeRIP-seq存在一些缺點(diǎn)坎缭，如相對(duì)較低的檢測(cè)分辨率（約100-150 nt）和對(duì)低豐度RNA上的RNA甲基化位點(diǎn)不敏感。Molinie等人（2016年）改進(jìn)的m6A-MeRIP-seq開(kāi)發(fā)了m6A-LAIC-seq（m6A水平和異構(gòu)體特征序列）签钩，通過(guò)調(diào)整抗體使用掏呼、涉及各種內(nèi)標(biāo)調(diào)控和同時(shí)進(jìn)行上清液（m6A陰性部分）的NGS測(cè)序，計(jì)算m6A陽(yáng)性和m6A陰性部分的RNA表達(dá)铅檩，以在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)定量m6A的化學(xué)計(jì)量學(xué)（表2）憎夷。
(2)miCLIP-seq
通過(guò)將MeRIP技術(shù)與光交聯(lián)反應(yīng)結(jié)合，研究人員發(fā)明了UV誘導(dǎo)的抗體-RNA交聯(lián)方法來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組甲基化修飾昧旨，如PA-m6A-Seq（光交聯(lián)輔助m6A測(cè)序）（圖1C）拾给、m6A-CLIP（m6A交聯(lián)免疫沉淀）（和m6A/m7G-miCLIP（m6A/m7G甲基化單堿基分辨率交聯(lián)免疫沉淀）（圖1B和3B）祥得。m6A-CLIP和m6A/m7G-miCLIP均基于UV交聯(lián)RNA與m6A或m7G抗體在結(jié)合位點(diǎn)形成共價(jià)鍵，導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的C-T位點(diǎn)轉(zhuǎn)換或截?cái)嘟茫ㄟ^(guò)此方法可以準(zhǔn)確鑒定m6A位點(diǎn)并獲得單堿基分辨率甲基化圖譜（表2）级及。
(3)PA-m6A-seq
PA-m6A-seq（光交聯(lián)輔助m6A測(cè)序）方法依賴(lài)于4-硫尿苷（4SU，光敏感的核苷酸類(lèi)似物）在細(xì)胞培養(yǎng)期間并入poly(A) RNA中额衙，抗m6A免疫沉淀和UV交聯(lián)饮焦，隨后進(jìn)行靶向RNA洗脫和文庫(kù)構(gòu)建（圖1C）。與MeRIP-Seq或m6A-seq相比窍侧，該方法實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物接近單堿基分辨率全轉(zhuǎn)錄組m6A圖譜（表2）县踢。
(4)m5C-miCLIP-seq
甲基轉(zhuǎn)移酶可以催化體內(nèi)特定核酸堿基位點(diǎn)的RNA甲基化形成。m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2包含釋放（半胱氨酸271）和催化（半胱氨酸321）位點(diǎn)伟件。m5C-miCLIP（m5C甲基化單堿基分辨率交聯(lián)和免疫沉淀）利用這一特性硼啤，通過(guò)結(jié)合細(xì)胞中外源表達(dá)的NSUN2-C271A（NSUN2上的突變釋放位點(diǎn)）與UV交聯(lián)免疫沉淀，其中突變蛋白NSUN2-C271A和m5C修飾位點(diǎn)在UV交聯(lián)下強(qiáng)烈結(jié)合形成共價(jià)鍵斧账，這在RT-PCR過(guò)程中引起截?cái)嗷蛲蛔儯▓D2B）丙曙。因此，m5C-miCLIP也能夠以單堿基分辨率檢測(cè)m5C修飾位點(diǎn)（表2）其骄。
(5)AZA-IP-seq
AZA-IP-seq（5-氮胞嘧啶介導(dǎo)的RNA免疫沉淀測(cè)序）是另一種基于甲基轉(zhuǎn)移酶抗體的m5C檢測(cè)方法亏镰。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，5-氮胞嘧啶（5-azaC）拯爽，作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑之一索抓，可以隨機(jī)并入DNA和新生RNA中，并且也有能力與甲基轉(zhuǎn)移酶（外源和內(nèi)源）結(jié)合形成共價(jià)鍵毯炮。結(jié)合5-azaC處理和特定甲基轉(zhuǎn)移酶抗體（如NSUN2）的免疫沉淀逼肯，可以以單堿基分辨率檢測(cè)m5C修飾位點(diǎn)（圖2A，表2）桃煎。
基于化學(xué)反應(yīng)方法
(1) RNA-BisSeq
RNA亞硫酸鹽測(cè)序（RNA-BisSeq）是定量分析mRNA m5C甲基組的經(jīng)典方法之一篮幢。它依賴(lài)于用亞硫酸鹽預(yù)處理RNA，促使未修飾的C發(fā)生化學(xué)脫氨反應(yīng)并轉(zhuǎn)化為U为迈，而甲基化的胞嘧啶（m5C）保持為C三椿。經(jīng)過(guò)RT、cDNA合成和PCR過(guò)程后葫辐，U堿基轉(zhuǎn)化為T(mén)搜锰，從而可以區(qū)分m5C和C。通過(guò)生物信息學(xué)分析耿战，可以通過(guò)分析未轉(zhuǎn)化的胞嘧啶來(lái)鑒定m5C修飾位點(diǎn)蛋叼，同時(shí)，通過(guò)計(jì)算未轉(zhuǎn)化胞嘧啶的覆蓋率百分比來(lái)估計(jì)m5C甲基化水平（圖2D）”蜂蹋總的來(lái)說(shuō)狐胎，RNA-BisSeq不需要在細(xì)胞中表達(dá)外源基因或化學(xué)試劑，能夠準(zhǔn)確捕獲細(xì)胞和組織中原始的m5C修飾狀態(tài)歌馍。RNA-BisSeq被廣泛用于探索各種RNA中m5C的表達(dá)特征握巢，并預(yù)測(cè)其潛在功能，包括哺乳動(dòng)物骆姐、斑馬魚(yú)、擬南芥和水稻捏题。RNA-BisSeq中m5C檢測(cè)的準(zhǔn)確性取決于亞硫酸鹽處理過(guò)程中C到U的轉(zhuǎn)化效率玻褪，這受到反應(yīng)條件（如溫度、反應(yīng)時(shí)間）和RNA狀態(tài)（如RNA質(zhì)量公荧、RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等）的影響（表2）带射。
(2)m6A-SEAL-seq
FTO輔助的m6A選擇性化學(xué)標(biāo)記測(cè)序（m6A-SEAL-seq）是一種利用FTO作為催化劑將m6A轉(zhuǎn)化為hm6A（N6-羥甲基腺苷）的化學(xué)標(biāo)記方法。不穩(wěn)定的hm6A將通過(guò)二硫蘇糖醇（DTT）介導(dǎo)的硫醇加成化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的dm6A（N6-二硫代肌醇甲腺苷）循狰。然后窟社，dm6A通過(guò)甲硫磺酸鹽（MTSEA）響應(yīng)組裝生物素標(biāo)簽，隨后進(jìn)行鏈霉親和純化和測(cè)序（圖1D）绪钥。m6A-SEAL分辨率約為200
nt（表2）灿里。
(3)m6A-label-seq
這種技術(shù)基于甲硫氨酸類(lèi)似物Se-烯丙基硒代同型半胱氨酸作為人類(lèi)和小鼠細(xì)胞的培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。這種類(lèi)似物可以驅(qū)動(dòng)甲基供體SAM被烯丙基團(tuán)標(biāo)記程腹，通過(guò)細(xì)胞自身代謝形成Allyl-SAM或Allyl-SeAM匣吊。因此，細(xì)胞RNA能夠在假定m6A生成腺苷位點(diǎn)被代謝性地修飾為N6-烯丙基腺苷（a6A）寸潦∩В基于碘化誘導(dǎo)的a6A環(huán)化和在cDNA逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中對(duì)側(cè)位點(diǎn)錯(cuò)配，實(shí)現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)單堿基分辨率檢測(cè)见转。m6A-label-seq的建立為理解m6A在分子水平上的生理作用提供了強(qiáng)有力的工具命雀，并且可以應(yīng)用于所有m6A motif。烯丙基團(tuán)標(biāo)記的效率和時(shí)間窗口對(duì)于準(zhǔn)確鑒定m6A位點(diǎn)至關(guān)重要（表2）斩箫。
(4)m6A-SAC-seq
m6A選擇性烯丙基化學(xué)標(biāo)記和測(cè)序（m6A-SAC-seq）是單堿基分辨率繪制全轉(zhuǎn)錄組m6A圖譜方法之一吏砂。這種方法的本質(zhì)是使用Dim1/KsgA家族的二甲基轉(zhuǎn)移酶酶（MjDim1）在m6A上添加烯丙基SAM化學(xué)基團(tuán)形成烯丙基6m6A，隨后在I2處理后發(fā)生環(huán)化乘客。環(huán)化的烯丙基6m6A在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中將被read為突變赊抖。根據(jù)突變r(jià)eads，可以定量和分析轉(zhuǎn)錄組中m6A沉積位點(diǎn)（圖1F）寨典。m6A-SAC-seq能夠覆蓋幾乎所有經(jīng)典的m6A motif氛雪，并已應(yīng)用于檢測(cè)HeLa、HEK293耸成、HepG2以及造血干細(xì)胞（HSC）和單核細(xì)胞中的m6A水平报亩。m6A-SAC-seq的初始樣本量約為30ng的poly(A)或rRNA耗盡RNA（表2）浴鸿。
(5)GLORI
類(lèi)似于RNA m5C的RNA-BisSeq，乙二醛和亞硝酸鹽介導(dǎo)的未甲基化腺苷的脫氨（GLORI）也是一種無(wú)偏倚弦追、絕對(duì)基于化學(xué)反應(yīng)的m6A定量方法岳链。該程序包含三個(gè)連續(xù)步驟：①使用乙二醛形成可逆結(jié)構(gòu)保護(hù)G（N1, N2-二羥基鳥(niǎo)嘌呤加合物）以避免亞硝酸鹽誘導(dǎo)的G脫氨；②未甲基化的A通過(guò)亞硝酸鹽催化的脫氨反應(yīng)轉(zhuǎn)化為I劲件；③通過(guò)堿性或加熱條件處理實(shí)現(xiàn)G的脫保護(hù)（圖1G）掸哑。GLORI的主要優(yōu)勢(shì)是實(shí)現(xiàn)RNA中m6A定量分析，但GLORI成本高于m6A
MeRIP-seq零远，且GLORI無(wú)法區(qū)分m6A和其他一些A修飾苗分，如m6Am和m1A，盡管技術(shù)發(fā)明者聲稱(chēng)已開(kāi)發(fā)出分析流程來(lái)消除由m6Am和m1A引起的假陽(yáng)性（表2）牵辣。
(6)eTAM-seq
進(jìn)化的TadA輔助N6-甲基腺苷測(cè)序（eTAM-seq）是一種基于酶促脫氨反應(yīng)的單堿基分辨率m6A測(cè)序方法摔癣，用于全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)定量檢測(cè)m6A位點(diǎn)。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)纬向，使用高活性的tRNA腺苷脫氨酶TadA8.20進(jìn)行脫氨反應(yīng)择浊，全局未甲基化的A轉(zhuǎn)化為I，只能與C配對(duì)并在隨后的逆轉(zhuǎn)錄逾条、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序過(guò)程中被讀為G琢岩。修飾的m6A保持不變，在測(cè)序過(guò)程中仍然被讀為A师脂。因此粘捎，通過(guò)eTAM-seq，A被讀為G危彩，m6A被讀為A攒磨。eTAM-seq能夠在極少量RNA中（低至10個(gè)細(xì)胞的RNA）進(jìn)行m6A的定量檢測(cè)，其初始RNA需求遠(yuǎn)低于現(xiàn)有的m6A定量分析方法（圖1H）汤徽。
(7)TAWO-seq
TET輔助的過(guò)鎢酸鹽氧化測(cè)序（TAWO-seq）也是一種RNA m5C單堿基分辨率測(cè)序方法娩缰，主要包含三個(gè)連續(xù)程序，包括由β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（βGT）標(biāo)記保護(hù)的原始hm5C谒府，由TET酶氧化的原始m5C轉(zhuǎn)化為hm5C拼坎，以及由過(guò)鎢酸鹽介導(dǎo)的新生成hm5C的選擇性氧化為三羥基胸腺嘧啶（thT）（圖2E）。這項(xiàng)技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)是與RNA-BisSeq相比能夠區(qū)分m5C和hm5C完疫。
(8)m7G-seq
m7G上的正電荷對(duì)NaBH4介導(dǎo)的還原特別敏感泰鸡。m7G-seq采用NaBH4介導(dǎo)的還原，在m7G位置上產(chǎn)生一個(gè)堿性位點(diǎn)壳鹤，然后這些位點(diǎn)被生物素標(biāo)記盛龄，隨后進(jìn)行生物素下拉實(shí)驗(yàn)。在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，RNA中的生物素標(biāo)記m7G位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)配（主要是T以及其他堿基）余舶，從而實(shí)現(xiàn)基于這些突變的m7G甲基組的單堿基分辨率（圖3C啊鸭，表2）。
基于酶切反應(yīng)技術(shù)
MAZTER-seq和m6A-REF-seq（m6A敏感的RNA內(nèi)切核酸酶促進(jìn)的測(cè)序）是同時(shí)報(bào)道不依賴(lài)抗體的方法匿值，用于定量m6A的化學(xué)計(jì)量分析赠制。這兩種方法都依賴(lài)于RNA內(nèi)切核酸酶MazF對(duì)ACA motif上的m6A識(shí)別，能夠在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)以單堿基分辨率檢測(cè)m6A修飾位點(diǎn)及其豐度挟憔。MazF在mRNA上更傾向于識(shí)別A-CA motif钟些。由于RNA上m6A的motif是RRACH（R=A/G，H=A/C/U）绊谭，大多數(shù)經(jīng)過(guò)MazF酶處理后的讀段將在5'端含有ACA政恍，因此內(nèi)部的(m6A)CA基序被認(rèn)定為甲基化位點(diǎn)（圖1I和J）。然而龙誊，這兩種方法都受限于內(nèi)切核酸酶對(duì)m6A CA序列的選擇性抚垃，這使得不包含m6A CA序列的序列無(wú)法被識(shí)別（表2）喷楣。
基于RNA編輯的技術(shù)
DART-seq（脫氨基作用鄰近RNA修飾靶標(biāo)測(cè)序）是一種不依賴(lài)抗體的方法趟大，通過(guò)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源性的APOBEC1-YTH融合蛋白來(lái)檢測(cè)全局m6A修飾位點(diǎn)。其中铣焊，YTH（m6A結(jié)合域）識(shí)別m6A逊朽，而連接的APOBEC1（胞嘧啶脫氨酶）直接將胞嘧啶殘基上的C編輯為U。這些編輯位點(diǎn)在后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中被識(shí)別為m6A修飾區(qū)域（圖1K）曲伊。由于YTH結(jié)構(gòu)域與m6A的2'-OH之間的氫鍵鍵合是關(guān)鍵結(jié)構(gòu)叽讳，DART-seq中的YTH結(jié)構(gòu)域無(wú)法識(shí)別m6Am。盡管DART-seq能夠從低量RNA（約10 ng總RNA）中繪制m6A位點(diǎn)坟募，但需要將APOBEC1-YTH短暫轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞要求限制了其應(yīng)用岛蚤，并且可能破壞了生理狀態(tài)（表2）。
基于單細(xì)胞RNA甲基化檢測(cè)技術(shù)
與單細(xì)胞組學(xué)圖譜相比，傳統(tǒng)的群體細(xì)胞測(cè)序方法使用的樣本包含成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞群叶，因此只能反映群體中的平均甲基化水平吃挑。特別是，細(xì)胞表達(dá)的異質(zhì)性在很大程度上被掩蓋街立，無(wú)法準(zhǔn)確反映組織/器官的真實(shí)生理或病理特征舶衬。目前已經(jīng)建立單細(xì)胞水平的測(cè)序技術(shù)，用于繪制轉(zhuǎn)錄組赎离、染色質(zhì)開(kāi)放可及性逛犹、DNA甲基化修飾等圖譜。報(bào)道的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組甲基化圖譜技術(shù)包括scDART-seq和scm6A-seq梁剔。
(1)scDART-seq
scDART-seq是在引入10X
Genomics單細(xì)胞測(cè)序后從DART-seq發(fā)展而來(lái)虽画，是首個(gè)單細(xì)胞水平的m6A檢測(cè)方法。通過(guò)應(yīng)用scDART-seq荣病，在成千上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞中進(jìn)行m6A圖譜分析码撰，發(fā)現(xiàn)m6A在單細(xì)胞水平上表現(xiàn)出高度異質(zhì)性，并且可以根據(jù)RNA甲基化特征區(qū)分細(xì)胞亞群个盆，與基因表達(dá)水平無(wú)關(guān)脖岛。這些發(fā)現(xiàn)揭示以前在bulk-cell
m6A分析中被忽視的m6A基本特征，并為理解m6A在不同細(xì)胞中的功能提供新見(jiàn)解（圖1L）颊亮。但由于scDART-seq基于外源基因表達(dá)柴梆，因此很難應(yīng)用于組織樣本，也無(wú)法呈現(xiàn)細(xì)胞的原始狀態(tài)（表2）终惑。
(2)scm6A-seq
通過(guò)結(jié)合RNA多重標(biāo)記和MeRIP-seq/m6A-IP绍在，scm6A-seq能夠捕獲全轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A圖譜，并能夠在不表達(dá)任何外源基因的情況下比較單細(xì)胞中的m6A水平狠鸳。它已被用于區(qū)分有核仁包圍（SN）和無(wú)核仁包圍（NSN）的卵母細(xì)胞揣苏，以單細(xì)胞分辨率繪制小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育和合子基因組激活期間的m6A調(diào)控機(jī)制（圖1M，表2）件舵。
(3)picoMeRIP-seq
picoMeRIP-seq也是一種基于m6A抗體的低輸入RNA/細(xì)胞或單細(xì)胞啟動(dòng)的m6A圖譜方法卸察。與scm6A-seq相比，picoMeRIP-seq不標(biāo)記單細(xì)胞中的RNA铅祸，后續(xù)文庫(kù)構(gòu)建直接使用商業(yè)的SMART-Seq stranded kit（TaKaRa）坑质。在這種方法中合武，通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化關(guān)鍵步驟提高了m6A/A富集比率，包括增加洗滌劑（SDS）和鹽（NaCl）濃度涡扼，使用低結(jié)合管和商業(yè)m6A抗體（Millipore）等（圖1N）稼跳。picoMeRIP-seq已用于在100 pg poly(A) RNA、單個(gè)斑馬魚(yú)合子吃沪、單個(gè)小鼠卵母細(xì)胞和植入前胚胎汤善、小鼠胚胎干細(xì)胞（1,000、100和10個(gè)細(xì)胞）的全轉(zhuǎn)錄組水平上繪制m6A（表2）票彪。
綜上所述红淡，過(guò)去十年中RNA甲基化測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展使我們能夠更清晰地了解RNA甲基化修飾的分布特征和功能機(jī)制。盡管每種技術(shù)都有其自身的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)降铸，但它們可以從多個(gè)維度進(jìn)行補(bǔ)償或校正在旱，以獲得更準(zhǔn)確的RNA甲基化位點(diǎn)信息。此外推掸，在單堿基精度和單細(xì)胞水平上取得了技術(shù)突破桶蝎，這可以更精細(xì)地捕獲細(xì)胞間RNA甲基化的異質(zhì)性，并建立單細(xì)胞水平的RNA甲基化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)谅畅。
生物學(xué)功能
RNA過(guò)程和代謝
作為轉(zhuǎn)錄后修飾登渣，RNA甲基化參與RNA代謝的整個(gè)過(guò)程，如pre-mRNA剪切铃彰、mRNA出核绍豁、mRNA降解或穩(wěn)定性以及mRNA翻譯芯咧。
pre-mRNA剪切
pre-mRNA剪切作為基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的第一階段牙捉，是去除pre-mRNA中內(nèi)含子、有序連接外顯子以最終生成成熟mRNA的過(guò)程敬飒。pre-mRNA可變剪切是這一過(guò)程中的關(guān)鍵步驟邪铲，它可以從一個(gè)基因生成多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，為遺傳多樣性和復(fù)雜性做出貢獻(xiàn)无拗。m6A去甲基化酶（FTO和ALKBH5）和甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（WTAP带到、METTL3和METTL14）定位于核斑點(diǎn)中，提示m6A在RNA剪切中的潛在作用英染。FTO優(yōu)先結(jié)合內(nèi)含子區(qū)域pre-mRNA揽惹，靠近可變剪切（AS）外顯子和聚腺苷酸位點(diǎn)，并調(diào)控可變剪切和3′UTR表達(dá)四康。
m6A
reader蛋白hnRNPG結(jié)合到共轉(zhuǎn)錄新生的m6A修飾pre-mRNA搪搏，并通過(guò)對(duì)RNA聚合酶II的互作及其在hnRNPG調(diào)控外顯子周?chē)恼嘉挥绊憗?lái)調(diào)控可變剪切。此外闪金，m6A分布在圍繞5′-和3′-剪切位點(diǎn)的外顯子區(qū)域，并與SRSF1和SRSF2的結(jié)合簇空間重疊聪姿。在3T3-L1細(xì)胞中敲除FTO增強(qiáng)了m6A水平很泊，并促進(jìn)了SRSF2蛋白的RNA結(jié)合能力，該蛋白調(diào)控脂肪生成調(diào)控因子RUNX1T1的可變剪切和隨后的前脂肪細(xì)胞分化恃疯。同時(shí)，有報(bào)道稱(chēng)m6A參與依賴(lài)其閱讀蛋白YTHDC1的pre-mRNA剪切墨闲，促進(jìn)pre-mRNA剪切因子SRSF3（SRp20）而阻止SRSF10（SRp38）進(jìn)入目標(biāo)mRNA的結(jié)合區(qū)域今妄。小鼠卵母細(xì)胞中的Ythdc1與pre-mRNA 3′端處理因子（CPSF6、SRSF3和SRSF7）互作鸳碧，并以m6A依賴(lài)方式廣泛參與可變聚腺苷酸化和改變3′UTR長(zhǎng)度蛙奖。果蠅中YTH家族蛋白的同源物YT521-B介導(dǎo)依賴(lài)于m6A的pre-mRNA可變剪切，并調(diào)控果蠅的神經(jīng)功能和性別決定杆兵。Louloupi等人報(bào)告稱(chēng)雁仲，剪切位點(diǎn)上的m6A沉積促進(jìn)快速剪切，而內(nèi)含子中高m6A水平與慢可變剪切相關(guān)琐脏。有趣的是攒砖，m6A開(kāi)關(guān)調(diào)控HNRNPC結(jié)合活性，其中m6A主導(dǎo)RNA和reader蛋白互作的RNA結(jié)構(gòu)依賴(lài)性可及性日裙，促進(jìn)外顯子保守并影響目標(biāo)mRNA的可變剪切吹艇。總的來(lái)說(shuō)昂拂，m6A對(duì)pre-mRNA成熟過(guò)程發(fā)揮重要作用受神，但m5C或m7G是否也參與這一過(guò)程尚不清楚。
mRNA出核
mRNA出核是基因表達(dá)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟格侯，mRNA通過(guò)這一步驟被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯鼻听。大多數(shù)mRNA出核依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄出核復(fù)合體（TREX）和核異二聚體出核受體（NXF1-P15）通路，其中TREX復(fù)合體成員被沉積在mRNA上并將其交給NXF1联四。
YTHDC1通過(guò)剪切因子SRSF3和出核接頭NXF1促進(jìn)含m6A的mRNA出核撑碴。研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)TREX亞基（ALYREF、UAP56朝墩、THOC5醉拓、CHTOP）與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（WTAP、METTL3收苏、METTL14亿卤、KIAA1429）互作，調(diào)控轉(zhuǎn)錄本出核鹿霸。Mettl3在細(xì)胞核中顯著增加了時(shí)鐘基因Per2和Arntl的mRNA積累排吴，而細(xì)胞中ALKBH5缺失加速了mRNA的RNA出核。同時(shí)杜跷，HeLa細(xì)胞中YTHDC1缺失導(dǎo)致m6A修飾的mRNA核積聚傍念，而在細(xì)胞質(zhì)中缺失矫夷。
除了m6A，m5C也在mRNA出核中發(fā)揮關(guān)鍵作用憋槐。ALYREF不僅是m5C reader蛋白双藕，也是調(diào)控核質(zhì)穿梭的TREX亞基之一。在HeLa細(xì)胞中阳仔，ALYREF促進(jìn)含m5C的mRNA出核忧陪。3T3-L1細(xì)胞中NSUN2的缺乏導(dǎo)致ALYREF-m5C軸介導(dǎo)的CDKN1A mRNA出核減少，導(dǎo)致細(xì)胞周期加速和促進(jìn)脂肪形成近范。
mRNA降解和穩(wěn)定性
m6A修飾參與調(diào)控mRNA代謝嘶摊。在野生型mESCs中，Mettl3和Mettl14組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體在標(biāo)靶轉(zhuǎn)錄本上催化m6A形成评矩，隨后阻止與mRNA穩(wěn)定性相關(guān)蛋白HuR的結(jié)合叶堆，并增強(qiáng)microRNA靶點(diǎn)，導(dǎo)致目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定斥杜。YTHDF2是一個(gè)經(jīng)典的m6A reader蛋白虱颗，它通過(guò)多種通路促進(jìn)含有m6A的靶轉(zhuǎn)錄本降解。首先蔗喂，Wang等人（2014a）分析了YTHDF2蛋白結(jié)構(gòu)忘渔，發(fā)現(xiàn)YTHDF2的羧基末端域（C-YTHDF2）選擇性地識(shí)別含m6A mRNA，而氨基末端域（N-YTHDF2）負(fù)責(zé)將YTHDF2-m6A-mRNA復(fù)合體定位到更專(zhuān)門(mén)的mRNA降解機(jī)器（如P體等）缰儿。其次畦粮，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的YTHDF2招募CCR4-NOT脫腺苷酸酶復(fù)合體，加速含m6A RNA的脫腺苷酸化和降解乖阵。此外宣赔，YTHDF2還與HRSP12互作，招募RNase
P/MRP復(fù)合體（內(nèi)切核糖核蛋白酶復(fù)合體）义起，以切割含m6A的RNA拉背。YTHDF2介導(dǎo)的m6A甲基化mRNA的降解在各種發(fā)育和疾病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用师崎，如維持造血干細(xì)胞功能默终、在卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)生過(guò)程中母源mRNA降解、癌癥進(jìn)展等犁罩。
與YTHDF2作用不同齐蔽，另一個(gè)m6A reader蛋白IGF2BPs參與維持穩(wěn)定性和儲(chǔ)存，并在正常和應(yīng)激條件下影響目標(biāo)m6A甲基化mRNA基因表達(dá)床估。IGF2BPs介導(dǎo)的m6A修飾mRNA的穩(wěn)定性參與腫瘤形成含滴。
m5C修飾在mRNA穩(wěn)定性中也表現(xiàn)出類(lèi)似的作用。兩項(xiàng)平行研究報(bào)告稱(chēng)丐巫，m5C reader蛋白YBX1通過(guò)招募RNA穩(wěn)定性相關(guān)蛋白（HuR或PABPC1a）影響目標(biāo)mRNA穩(wěn)定性谈况，并因此參與膀胱尿路上皮癌（UCB）的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移勺美，以及斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育。在小鼠Th17細(xì)胞中NSUN2缺失以m5C依賴(lài)方式導(dǎo)致Il17a和Il17f mRNAs的半衰期和數(shù)量減少碑韵。
翻譯
RNA甲基化已被證明可以促進(jìn)或抑制翻譯過(guò)程赡茸。在細(xì)胞質(zhì)中，YTHDF1富集在40S核糖體的蛋白質(zhì)亞基中祝闻，并與翻譯啟動(dòng)復(fù)合體的組成部分eIF3互作占卧，從而促進(jìn)m6A依賴(lài)的mRNA翻譯。YTHDF3也與YTHDF1協(xié)同促進(jìn)蛋白質(zhì)合成联喘。另一項(xiàng)平行研究也報(bào)告稱(chēng)华蜒，YTHDF3與YTHDF1合作，通過(guò)在翻譯過(guò)程中順序招募翻譯效應(yīng)物（40S和60S核糖體亞基）來(lái)促進(jìn)m6A修飾目標(biāo)mRNA的翻譯效率豁遭“认玻總體而言，YTHDF1和YTHDF3通過(guò)與YTHDF1/YTHDF3鏈接蓖谢，在轉(zhuǎn)錄本m6A修飾的3'端和40S和60S亞基的翻譯效應(yīng)物的5'端之間形成loop域滥，調(diào)控翻譯啟動(dòng)。最近的報(bào)告還說(shuō)明了幾條分子通路參與YTHDF1或YTHDF3介導(dǎo)的m6A修飾轉(zhuǎn)錄本的翻譯過(guò)程蜈抓。Zou等人（2023年）報(bào)告稱(chēng)启绰，YTHDF1與核糖體蛋白結(jié)合以促進(jìn)其目標(biāo)mRNA翻譯，但FMRP通過(guò)阻礙YTHDF1與核糖體蛋白的結(jié)合來(lái)抑制神經(jīng)翻譯沟使。然而在神經(jīng)刺激下委可，F(xiàn)MRP被磷酸化并釋放YTHDF1，以提高m6A甲基化mRNA翻譯效率腊嗡，從而促進(jìn)神經(jīng)去極化着倾。同時(shí)，Chen等人（2023年）已經(jīng)證明YTHDF1和YTHDF3（不是YTHDF2）攜帶高水平的營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)O-GlcNAc修飾燕少，O-GlcNAcylation通過(guò)抑制它們與mRNA翻譯相關(guān)蛋白互作卡者，抑制YTHDF1和YTHDF3的翻譯促進(jìn)功能，導(dǎo)致m6A甲基化mRNA翻譯抑制客们。Chen等人（2023年）還建議不同的細(xì)胞在YTHDF1/3上表現(xiàn)出不同的O-GlcNAc修飾水平崇决，這可能是先前研究對(duì)YTHDF1/3是否促進(jìn)m6A RNA翻譯功能得出不同結(jié)論的原因之一。此外底挫，當(dāng)m6A位于5'UTR時(shí)恒傻，它可以通過(guò)被43S復(fù)合體組分eIF3識(shí)別，在細(xì)胞應(yīng)激下促進(jìn)帽的單獨(dú)翻譯建邓。另一個(gè)reader蛋白YTHDC2也以m6A依賴(lài)方式增強(qiáng)其靶標(biāo)翻譯效率盈厘。盡管如此，Choi等人（2016年）證明官边，轉(zhuǎn)錄本中m6A修飾密碼子通過(guò)破壞轉(zhuǎn)錄本上tRNA的選擇導(dǎo)致翻譯延伸動(dòng)態(tài)更慢和翻譯效率更低沸手。此外外遇，Lin等人（2016年）發(fā)現(xiàn)METTL3，而不依賴(lài)其m6A催化活性契吉，通過(guò)招募eIF3到翻譯啟動(dòng)復(fù)合體臀规，增強(qiáng)包括重要的癌基因如EGFR和TAZ在內(nèi)的目標(biāo)mRNA翻譯，導(dǎo)致人類(lèi)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)栅隐、存活和侵襲得到促進(jìn)塔嬉。
m5C廣泛分布在rRNA和tRNA變區(qū)和反密碼loop上，通過(guò)調(diào)控tRNA穩(wěn)定性和密碼子識(shí)別租悄、翻譯保真度和準(zhǔn)確性或全局蛋白質(zhì)合成等參與翻譯調(diào)控谨究。mRNA上的m5C也參與調(diào)控翻譯效率，在3T3-L1細(xì)胞中泣棋，NSUN2以m5C依賴(lài)的方式促進(jìn)CDKN1A
mRNA的翻譯效率胶哲。在大鼠的T淋巴細(xì)胞中，NSun2介導(dǎo)的m5C修飾在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)下促進(jìn)IL-17A mRNA的翻譯潭辈。此外鸯屿，NSUN6特異性m5C位點(diǎn)富集在3'UTR中的CTCCA motif上，與翻譯終止保真相關(guān)把敢。然而寄摆，Tang等人（2015年）報(bào)告稱(chēng)NSun2通過(guò)在p27
mRNA的5'UTR上的胞嘧啶C64上甲基化，抑制p27翻譯修赞，表明mRNA上m5C位點(diǎn)可能決定其對(duì)翻譯效率的調(diào)控效應(yīng)婶恼。
真核mRNA的5'帽上m7G已被證明參與翻譯調(diào)控。最近的研究還表明柏副，mRNA內(nèi)部的m7G修飾在mRNA翻譯通路中起作用勾邦。METTL1組裝的內(nèi)部m7G修飾能夠促進(jìn)m7G修飾轉(zhuǎn)錄本翻譯效率，而不依賴(lài)于其對(duì)全局翻譯和tRNA甲基化的影響割择。內(nèi)部m7G在人類(lèi)mRNA沿的表現(xiàn)顯示在翻譯起始位點(diǎn)保守富集眷篇，而在H2O2或熱休克處理下在CDS和3'UTR區(qū)域顯著積累，促進(jìn)mRNA翻譯效率荔泳。此外蕉饼，METTL1介導(dǎo)的m7G甲基化增強(qiáng)VEGFA mRNA翻譯，促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的血管生成换可。
綜上所述椎椰，RNA甲基化修飾在包括pre-RNA處理、mRNA代謝和翻譯在內(nèi)的整個(gè)mRNA表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要作用沾鳄，凸顯其生物學(xué)意義。Li等人（2017c）證明METTL3/METTL14介導(dǎo)的m6A和NSUN2介導(dǎo)的m5C甲基化在p21 3'UTR中協(xié)同增強(qiáng)p21翻譯确憨，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老中導(dǎo)致p21表達(dá)升高译荞，表明多種RNA甲基化修飾可能協(xié)同調(diào)控同一生物學(xué)事件瓤的。然而，仍然需要揭示這些修飾單獨(dú)或協(xié)同調(diào)控mRNA表達(dá)過(guò)程的更多調(diào)控機(jī)制吞歼，這將有助于描繪多種RNA甲基化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圈膏。
哺乳動(dòng)物發(fā)育
配子發(fā)生
一系列最新研究表明，RNA甲基化表觀轉(zhuǎn)錄組在精子發(fā)生和卵子發(fā)生中扮演著至關(guān)重要的角色篙骡。Guo等人（2022年）通過(guò)LC-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)稽坤，多種RNA修飾（如m5C、m3C糯俗、m7G尿褪、m2G、m22G得湘、m1G和m1A）分布在人類(lèi)精子的RNA中杖玲，這些修飾在弱精子癥（AZS）和畸精子癥（TZS）組中的水平顯著高于正常精子癥（NZS）組，特別是在TZS組中m5C和m6A的水平更高淘正。在精子發(fā)生過(guò)程中摆马，m6A作為一個(gè)重要的調(diào)控因子，參與哺乳動(dòng)物精原細(xì)胞的有絲分裂鸿吆、減數(shù)分裂和精子形成囤采。Mettl3介導(dǎo)的m6A調(diào)控精原干細(xì)胞（SSCs）的增殖和分化，并影響減數(shù)分裂的啟動(dòng)惩淳。在雄性生殖細(xì)胞中敲除METTL3或METTL14會(huì)導(dǎo)致睪丸組織中SSCs快速耗竭甚至完全缺失斑唬。人類(lèi)精子中METTL3上調(diào)導(dǎo)致m6A水平增加，進(jìn)而增強(qiáng)精子運(yùn)動(dòng)能力黎泣，這是弱精子癥的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素恕刘。此外，小鼠支持細(xì)胞特異性敲除Wtap會(huì)損害SSCs的自我更新和增殖能力抒倚，最終導(dǎo)致不育褐着，通過(guò)干擾Wtap介導(dǎo)的m6A修飾基因的可變剪切。此外托呕，ALKBH5介導(dǎo)的小鼠精原細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞核中的m6A參與正確剪切和較長(zhǎng)3'UTR mRNAs生成含蓉，這是精子發(fā)生的晚期減數(shù)分裂和單倍體階段所必需的。敲除FTO會(huì)導(dǎo)致GC-1精原細(xì)胞系的染色體不穩(wěn)定和G2/M階段轉(zhuǎn)換抑制项郊。在小鼠中馅扣，Ythdc2在雄性或雌性生殖細(xì)胞中敲除導(dǎo)致異常的配子減數(shù)分裂，導(dǎo)致不育和睪丸及卵巢體積減小着降。同時(shí)差油，小鼠減數(shù)分裂細(xì)胞中條件性敲除Ythdc2導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組嚴(yán)重失調(diào)，包括編碼微管網(wǎng)絡(luò)蛋白的轉(zhuǎn)錄本，并導(dǎo)致減數(shù)分裂細(xì)胞和精原細(xì)胞在晚期減數(shù)分裂階段的端粒聚集和凋亡蓄喇。成年雄性小鼠Ythdc1缺陷導(dǎo)致缺乏任何生殖細(xì)胞发侵，包括有絲分裂精原細(xì)胞，并表現(xiàn)出僅支持細(xì)胞的表型妆偏。在小鼠精原細(xì)胞中敲除Ythdf2通過(guò)m6A/mRNA降解通路下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)刃鳄，并影響細(xì)胞粘附和精原細(xì)胞增殖。此外钱骂，敲除m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSun2對(duì)精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞沒(méi)有影響叔锐，但抑制了生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂的減數(shù)分裂階段。
在卵子發(fā)生過(guò)程中见秽，METTL3介導(dǎo)的m6A通過(guò)促進(jìn)母源mRNA翻譯效率對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟是必需的愉烙。在卵母細(xì)胞的生殖泡（GV）階段敲低Mettl3嚴(yán)重抑制卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟。同時(shí)张吉，Yao等人（2023年）證明METTL3催化的m6A沉積促進(jìn)了GV期卵母細(xì)胞中m6A修飾RNA降解齿梁。然而，Mu等人（2021年）報(bào)告稱(chēng)METTL3靶向Itsn2進(jìn)行m6A修飾肮蛹，隨后增強(qiáng)其在GV階段的穩(wěn)定性勺择，以促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中減數(shù)分裂的恢復(fù)。此外伦忠，母源YTHDF2負(fù)責(zé)以m6A依賴(lài)方式指導(dǎo)適當(dāng)?shù)哪冈崔D(zhuǎn)錄本劑量省核，從而決定哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞質(zhì)量和雌性生育能力。卵母細(xì)胞中Ythdc1缺陷導(dǎo)致m6A依賴(lài)的可變剪切缺陷昆码，導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟停滯和雌性不孕气忠。在卵母細(xì)胞中特異性敲除KIAA1429導(dǎo)致GV期卵母細(xì)胞中m6A修飾RNA的異常代謝，導(dǎo)致GV卵母細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行生殖泡破裂（GVBD）和隨后失去恢復(fù)減數(shù)分裂能力赋咽。此外旧噪，卵巢中Nsun5缺失導(dǎo)致m5C在mRNA外顯子和3'UTR區(qū)域的時(shí)間依賴(lài)性下降，影響減數(shù)分裂阻滯缺陷2樣2（MAD2L2）的mRNA穩(wěn)定性脓匿、生長(zhǎng)分化因子9（GDF9）的翻譯效率淘钟、以及Brd8外顯子區(qū)域的異常可變剪切陪毡，導(dǎo)致卵泡發(fā)育和卵巢功能障礙米母。有趣的是，NSUN2在人類(lèi)和小鼠MI/MII期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)毡琉，可能促進(jìn)NSUN2蛋白與母源mRNAs互作铁瞒，并催化m5C形成。卵母細(xì)胞中m5C修飾轉(zhuǎn)錄本的逐漸增加和沉積可能在早期胚胎發(fā)生中起作用桅滋。
早期胚胎發(fā)育
RNA甲基化修飾在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用慧耍。在體外，小鼠GV期卵母細(xì)胞中METTL3缺失會(huì)阻礙受精后胚胎發(fā)育中的母系到合子轉(zhuǎn)變（MZT）和合子基因組激活，可能是通過(guò)破壞母源mRNA降解蜂绎。小鼠胚胎4細(xì)胞階段的轉(zhuǎn)錄因子mRNA上栅表，如Cdx2笋鄙、Nanog师枣、Sox2和Pou5f1的m6A修飾，可能參與調(diào)控合子基因激活（ZGA）過(guò)程萧落。m6A reader蛋白YTHDF2在母源上是必需的践美，對(duì)于卵母細(xì)胞的能力和早期MZT過(guò)程，具有清除m6A修飾的母源mRNA作用找岖。由METTL3依賴(lài)的m6A甲基化調(diào)控的HnRNPA2/B1在著床前胚胎發(fā)育期間在核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)陨倡，其功能缺陷會(huì)延緩4細(xì)胞階段后的胚胎發(fā)育，并通過(guò)對(duì)胚泡中多能性的調(diào)控影響內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）的形成许布。斑馬魚(yú)胚胎發(fā)生中的m5C reader蛋白YBX1招募Pabpc1a來(lái)維持m5C修飾的母源mRNA穩(wěn)定性兴革，促進(jìn)有序的MZT過(guò)程。
對(duì)于小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）蜜唾，Wang等人報(bào)告稱(chēng)m6A甲基化對(duì)于維持mESC在其基礎(chǔ)狀態(tài)至關(guān)重要杂曲，Mettl3或Mettl14缺失會(huì)導(dǎo)致mESC失去自我更新能力，這是由于HuR-microRNA和m6A介導(dǎo)的RNA穩(wěn)定性通路功能障礙袁余。Zc3h13靶向核中的WTAP擎勘、Virilizer和Hakai的成分復(fù)合體上，催化m6A形成颖榜，然后促進(jìn)mESC自我更新棚饵。Batista等人（2014年）證明小鼠和人類(lèi)ESC中Mettl3缺失降低了m6A修飾水平，延長(zhǎng)分化時(shí)Nanog表達(dá)掩完，導(dǎo)致促進(jìn)mESC自我更新和抑制mESC分化噪漾。此外，Mettl3介導(dǎo)的m6A甲基化維持多能性因子保真和及時(shí)下調(diào)且蓬，調(diào)控小鼠原始多能性解決過(guò)程中適當(dāng)?shù)淖V系啟動(dòng)和分化欣硼。Mettl14介導(dǎo)的m6A調(diào)控mRNA表達(dá)和可變剪切，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為原始多能性到啟動(dòng)多能性和外胚層分化的小鼠胚胎缅疟。更重要的是分别，METTL14缺失在E6.5和E7.5（胚胎日）導(dǎo)致嚴(yán)重的生長(zhǎng)遲緩和異常形態(tài)。
免疫系統(tǒng)發(fā)育
免疫細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞（HSCs）分化存淫，其命運(yùn)對(duì)整個(gè)免疫系統(tǒng)至關(guān)重要耘斩。越來(lái)越多的證據(jù)支持RNA甲基化從多個(gè)角度調(diào)控HSCs。斑馬魚(yú)胚胎中Mettl3缺失抑制了最早的HSPCs生成桅咆，通過(guò)破壞YTHDF2介導(dǎo)的動(dòng)脈內(nèi)皮基因 notch1a 和 rhoca 的m6A依賴(lài)性mRNA衰變括授。與斑馬魚(yú)中的功能一致，Mettl3-m6A-YTHDF2-Notch軸通路在小鼠HSPCs生成和明確的造血中也顯示出不可或缺和保守的功能。小鼠中階段特異性的Mettl3缺失導(dǎo)致HSCs積累荚虚，并因未能通過(guò)METTL3介導(dǎo)的m6A甲基化上調(diào)MYC表達(dá)而阻止HSC分化薛夜。Cheng等人（2019b）還證明m6A通過(guò)調(diào)控MYC mRNA穩(wěn)定性維持HSC對(duì)稱(chēng)。同時(shí)METTL14在正常髓系造血過(guò)程中表達(dá)下調(diào)版述，并通過(guò)正向調(diào)控MYB和MYC mRNA穩(wěn)定性和翻譯梯澜，基于m6A方式促進(jìn)HSPCs向髓系細(xì)胞分化。Ythdf2缺失通過(guò)促進(jìn)與干細(xì)胞自我更新相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子m6A介導(dǎo)的mRNA穩(wěn)定性渴析，促進(jìn)HSPCs和人類(lèi)臍帶血（hUCB）HSCs擴(kuò)增晚伙。Mapperley等人（2021年）還報(bào)告稱(chēng)，造血特異性Ythdf2缺失導(dǎo)致m6A修飾和炎癥反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)俭茧，并激活促炎通路咆疗，導(dǎo)致淋巴潛能喪失，隨后髓系偏向和HSC擴(kuò)增母债。并且老化的Ythdf2缺失HSCs導(dǎo)致多系造血重建失敗午磁。
RNA甲基化通過(guò)調(diào)控免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本代謝參與先天免疫。在巨噬細(xì)胞中毡们，SOCS1作為SOCS家族蛋白之一迅皇，參與巨噬細(xì)胞激活的負(fù)反饋回路，通過(guò)促進(jìn)目標(biāo)信號(hào)蛋白的多泛素化和蛋白酶體降解漏隐，以防止壓倒性的全身炎癥喧半，其在巨噬細(xì)胞中對(duì)感染的響應(yīng)依賴(lài)于METTL14-m6A-YTHDF1軸。METTL3缺失導(dǎo)致m6A介導(dǎo)的mRNA穩(wěn)定性和Irakm高表達(dá)青责，最終抑制TLR（Toll樣受體）信號(hào)介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活挺据。樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）作為連接先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的專(zhuān)業(yè)抗原呈遞細(xì)胞（APCs），對(duì)啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)脖隶、消除入侵病原體和維持免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要扁耐。Mettl3催化的mRNA m6A甲基化增強(qiáng)了CD40、CD80和TLR4信號(hào)接頭Tirap翻譯产阱，并促進(jìn)DC激活和TLR4/NF-κB信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生婉称。此外，NK細(xì)胞中的Ythdf2對(duì)IL-15/STAT5信號(hào)介導(dǎo)的NK細(xì)胞存活构蹬、增殖和效應(yīng)功能是必需的王暗，促進(jìn)NK細(xì)胞的抗腫瘤和抗病毒免疫活性。小鼠腫瘤模型中Mettl3缺失下調(diào)m6A甲基化基因SHP-2表達(dá)庄敛，可能導(dǎo)致NK細(xì)胞對(duì)IL-15刺激應(yīng)答降低俗壹，并抑制NK細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤(rùn)和功能。
除了先天免疫藻烤，RNA甲基化還參與調(diào)控適應(yīng)性免疫反應(yīng)绷雏。Mettl3介導(dǎo)SOCS家族蛋白SOCS1头滔、SOCS3和CISH的m6A形成及其隨后的降解，降低了SOCS家族活性涎显，從而促進(jìn)IL-7介導(dǎo)的STAT5激活和na?ve T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)增殖和分化坤检。在Tregs中敲除Mettl3/m6A增加了Socs mRNA表達(dá)，從而抑制IL-2-STAT5信號(hào)通路期吓，維持Tregs抑制功能早歇。Th17細(xì)胞敲除METTL3可以促進(jìn)SOCS3
mRNA穩(wěn)定性，從而抑制IL-17A和CCR5表達(dá)膘婶，破壞Th17細(xì)胞分化和浸潤(rùn)缺前。METTL3介導(dǎo)的m6A穩(wěn)定Tcf7轉(zhuǎn)錄本蛀醉，允許正常產(chǎn)生TCF-1蛋白及其調(diào)控的T濾泡輔助（Tfh）細(xì)胞調(diào)控因子悬襟，促進(jìn)了Tfh細(xì)胞分化、增殖和功能成熟拯刁。T細(xì)胞特異性敲除ALKBH5增強(qiáng)了CD4+
T細(xì)胞中m6A修飾水平脊岳，并下調(diào)Cxcl2和Ifng的mRNA穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)，導(dǎo)致CD4+
T細(xì)胞功能和中性粒細(xì)胞招募在自身免疫期間受到抑制垛玻。
與m6A相比割捅，關(guān)于其他RNA甲基化修飾在免疫細(xì)胞中的功能機(jī)制的研究相對(duì)較少。在高同型半胱氨酸血癥（HHcy）誘導(dǎo)的大鼠慢性炎癥疾病模型中帚桩，NSun2通過(guò)催化m5C形成及其在T淋巴細(xì)胞中促進(jìn)翻譯來(lái)介導(dǎo)IL-17A表達(dá)上調(diào)亿驾。Yang等人（2023年）還發(fā)現(xiàn)NSun2特別與Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RoRγt結(jié)合，催化其靶標(biāo)上的RNA m5C形成账嚎，包括Il17a和Il17f莫瞬，從而增強(qiáng)其mRNA穩(wěn)定性。小鼠CD4+ T細(xì)胞中Nsun2缺失特別抑制了Th17細(xì)胞分化郭蕉，并緩解Th17細(xì)胞誘導(dǎo)的結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制疼邀。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者的CD4+ T細(xì)胞中，Nsun2表達(dá)和m5C修飾水平下調(diào)召锈，高甲基化m5C轉(zhuǎn)錄本主要參與mRNA剪切旁振、穩(wěn)定和翻譯的細(xì)胞因子相關(guān)信號(hào)通路，而低甲基化m5C轉(zhuǎn)錄本主要參與翻譯延伸涨岁。
總的來(lái)說(shuō)拐袜，RNA甲基化修飾廣泛參與生物體的發(fā)育過(guò)程，并在配子發(fā)生梢薪、胚胎發(fā)生以及胚胎后神經(jīng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育等多個(gè)功能通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用蹬铺。目前，m6A在發(fā)育研究中的關(guān)注度比其他修飾更多沮尿。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步和各種RNA甲基化調(diào)控因子的鑒定丛塌，其他甲基化修飾在發(fā)育中的功能分析也可能變得有價(jià)值较解。
癌癥
目前，已有數(shù)百項(xiàng)研究證明RNA甲基化通過(guò)直接作用或其調(diào)控元件參與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控赴邻。以下僅總結(jié)一些最新的（過(guò)去五年）和尖端的關(guān)于腫瘤發(fā)生中RNA甲基化修飾的研究印衔。越來(lái)越多的證據(jù)表明m6A失調(diào)驅(qū)動(dòng)異常的轉(zhuǎn)錄和翻譯程序，并隨后促進(jìn)疾病或腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展姥敛，如白血病奸焙、肝細(xì)胞癌（HCC）、肺癌（LC）彤敛、結(jié)直腸癌（CRC）与帆、乳腺癌、膀胱癌（BC）墨榄、胰腺癌（PC）玄糟、胃癌（GC）、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤袄秩。m6A在癌細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用阵翎，包括通過(guò)調(diào)控代謝相關(guān)通路，如mTOR之剧、PTEN郭卫、MAPK、NF-κB背稼、Wnt信號(hào)通路等贰军，或轉(zhuǎn)錄因子，如HIF-1蟹肘、FOXM1词疼、cMyc、YAP疆前。m6A還參與重塑各種腫瘤免疫寒跳，通過(guò)調(diào)控免疫細(xì)胞的生存或功能，包括B細(xì)胞竹椒、CD8+ T細(xì)胞童太、CD4+ T細(xì)胞、PD-1+
T細(xì)胞胸完、Treg細(xì)胞书释、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞赊窥、巨噬細(xì)胞爆惧、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和CD4+記憶激活T細(xì)胞的浸潤(rùn)锨能，以及免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)扯再，如FN-γ芍耘、CXCL9和CXCL10∠ㄗ瑁總體而言斋竞，m6A影響腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移、代謝秃殉、免疫逃逸坝初，在診斷和治療方面具有潛在價(jià)值。
m5C調(diào)控因子钾军，如NSUN2的甲基轉(zhuǎn)移酶和YBX1的reader蛋白鳄袍，在腫瘤組織中高表達(dá)。m5Cs在腫瘤組織中也經(jīng)常出現(xiàn)高甲基化吏恭，并在致癌通路中富集拗小。NSUN2和YBX1在UCB中靶向HDGF基因3'UTR的m5C，調(diào)控HDGF mRNA穩(wěn)定性并促進(jìn)UCB發(fā)病機(jī)制砸泛。丙酮酸激酶肌肉同工酶M2（PKM2）十籍，作為一種限速的糖酵解酶，參與腫瘤代謝和生長(zhǎng)唇礁，其mRNA的3'UTR含有m5C位點(diǎn)。ALYREF直接識(shí)別PKM2 mRNA并以其m5C依賴(lài)性方式促進(jìn)其穩(wěn)定性惨篱，從而促進(jìn)糖酵解和膀胱癌的腫瘤發(fā)生盏筐。類(lèi)似的研究還表明，NSUN2介導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）中的m5C高甲基化通過(guò)增強(qiáng)LIN28B依賴(lài)的GRB2
mRNA穩(wěn)定性砸讳，激活致癌的PI3K/AKT和ERK/MAPK信號(hào)琢融，促進(jìn)ESCC的起始和進(jìn)展。NSUN2通過(guò)以m5C依賴(lài)方式上調(diào)TEAD1增強(qiáng)下咽鱗狀細(xì)胞癌（HPSCC）的增殖和侵襲簿寂。在HCC中漾抬，NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾在HCC中明顯高于相鄰非癌組織。m5C通過(guò)抑制Ras通路活性并增加HCC細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性來(lái)調(diào)控HCC進(jìn)展常遂，并且m5C修飾的lncRNA
H19招募G3BP1致癌蛋白促進(jìn)HCC發(fā)生和發(fā)展纳令。此外，蛋白質(zhì)翻譯后修飾通過(guò)修飾RNA甲基化reader蛋白參與調(diào)控m5C靶標(biāo)克胳，并影響腫瘤發(fā)生平绩。SIAH1通過(guò)泛素化和降解YBX1間接促進(jìn)m5C修飾RNA不穩(wěn)定性，抑制上皮卵巢癌細(xì)胞的增殖漠另、侵襲捏雌、遷移和藥物抗性。
幾項(xiàng)研究表明m7G tRNA修飾影響癌癥進(jìn)展笆搓。METTL1/WDR4敲除破壞m7G tRNA解碼密碼子形成性湿，降低mRNA翻譯效率并抑制肺癌纬傲、HCC、BC和鼻咽癌（NPC）進(jìn)展肤频。METTL1介導(dǎo)的HeLa細(xì)胞中mRNA內(nèi)部m7G也增強(qiáng)其靶標(biāo)mRNA的翻譯效率嘹锁，而不依賴(lài)其對(duì)全局翻譯和tRNA甲基化的影響。METTL1催化的人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFA mRNA上的m7G組裝增加了VEGFA翻譯着裹，并促進(jìn)缺血后血管生成领猾。這些研究表明內(nèi)部m7G可能參與癌癥進(jìn)展。
總體而言骇扇，RNA甲基化修飾在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用摔竿，但不同修飾是否在腫瘤發(fā)生中協(xié)同或拮抗作用值得進(jìn)一步研究。此外少孝，盡管許多由RNA甲基化修飾調(diào)控的靶標(biāo)和通路具有腫瘤診斷和治療的潛力继低，但實(shí)際應(yīng)用于臨床設(shè)置很少，需要進(jìn)一步深入研究以促進(jìn)臨床應(yīng)用稍走。
結(jié)論與展望
本文總結(jié)了包括m6A袁翁、m5C和m7G在內(nèi)的三種甲基化表觀轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控元件、分布特征婿脸、檢測(cè)技術(shù)以及生物學(xué)功能粱胜。由于RNA甲基化修飾在調(diào)控多種生理功能中的參與，主要概述了幾個(gè)熱點(diǎn)話(huà)題狐树，包括配子發(fā)生焙压、早期胚胎發(fā)生、免疫系統(tǒng)發(fā)育和疾病抑钟。盡管m6A和m5C RNA修飾的調(diào)控元件已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并廣泛研究涯曲，但關(guān)于其他RNA甲基化修飾的信息相對(duì)較少，特別是其erasers和readers需要確定在塔。隨著對(duì)其他RNA甲基化修飾動(dòng)態(tài)性質(zhì)的調(diào)控元件和機(jī)制的深入研究幻件，對(duì)其功能機(jī)制的更清晰理解將有助于建立整體RNA表觀遺傳修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種RNA甲基化修飾的測(cè)序技術(shù)蛔溃，但它們中的大多數(shù)只能很好地捕獲和分析高豐度而不是低豐度轉(zhuǎn)錄本中的修飾信息绰沥，而后者將是一個(gè)有意義的突破點(diǎn)。此外城榛，越來(lái)越多的研究表明RNA甲基化修飾參與多種生物過(guò)程和腫瘤發(fā)生揪利。然而，幾乎所有的研究都是在群體細(xì)胞水平上進(jìn)行的狠持，這可能會(huì)忽視或扭曲單個(gè)細(xì)胞中的真實(shí)信息疟位，限制對(duì)精確調(diào)控機(jī)制的理解，這對(duì)于指導(dǎo)疾病的精確靶向治療可能至關(guān)重要喘垂。因此甜刻，開(kāi)發(fā)高通量單細(xì)胞RNA甲基化技術(shù)應(yīng)該是該領(lǐng)域的創(chuàng)新點(diǎn)和推動(dòng)力绍撞。此外，幾項(xiàng)研究也表明多種RNA甲基化修飾可能共同調(diào)控某些生物過(guò)程得院。因此傻铣，探索不同RNA修飾之間的相互調(diào)控關(guān)系可能是未來(lái)的一個(gè)熱點(diǎn)話(huà)題，這對(duì)于構(gòu)建整體RNA表觀遺傳修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是必要的祥绞。目前能夠同時(shí)捕獲多種修飾的測(cè)序技術(shù)仍然相對(duì)較少非洲，修飾類(lèi)型的覆蓋范圍和靈敏度仍需改進(jìn)。因此蜕径，開(kāi)發(fā)新技術(shù)以同時(shí)檢測(cè)多種RNA表觀遺傳修飾是理解生物系統(tǒng)中整體作用模式的必要條件两踏。
從文章的疾病部分來(lái)看，RNA表觀遺傳修飾及其調(diào)控因子在各種腫瘤的增殖兜喻、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用梦染。此外，多個(gè)RNA甲基化修飾基因或其通路已被報(bào)道作為診斷或治療的潛在靶標(biāo)朴皆，但其目前的臨床應(yīng)用仍然非常有限帕识。因此，需要加強(qiáng)特定RNA甲基化修飾抑制劑的研究遂铡，這可能是實(shí)現(xiàn)RNA甲基化修飾臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的關(guān)鍵點(diǎn)肮疗，盡管已有一些抑制劑的報(bào)道，如FTO抑制劑忧便、Meclofenamic酸族吻、FB23/FB23-2、MA2珠增、Entacapone、DAC51砍艾、R-2HG蒂教、CS1/CS2、METTL3抑制劑（包括Compound 2/Compound 7）脆荷、STM2457凝垛、YTHDF2抑制劑（包括DC-Y13-27）和IGF2BP1抑制劑（包括BTYNB）。此外蜓谋，幾項(xiàng)研究表明RNA甲基化修飾可以用于靶向編輯梦皮。在細(xì)胞水平上，表達(dá)與截短的METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域融合的核定位dCas13桃焕，與修飾的METTL3-METTL14甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體和特定導(dǎo)向RNA融合的細(xì)胞質(zhì)定位剑肯，有能力在mRNA中將特定位點(diǎn)的腺苷修飾為m6A。Liu等人（2019b年）還設(shè)計(jì)了一個(gè)m6A動(dòng)態(tài)編輯系統(tǒng)观堂，將CRISPR-Cas9與單鏈m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3:METTL14融合以在特定位點(diǎn)編程m6A形成让网，同時(shí)將CRISPR-Cas9與ALKBH5或FTO融合以實(shí)現(xiàn)RNA的位點(diǎn)特異性去甲基化呀忧。然而，這些技術(shù)都是基于細(xì)胞內(nèi)編輯相關(guān)蛋白的表達(dá)溃睹，使得直接治療如人類(lèi)腫瘤等疾病變得困難而账，而其他RNA甲基化的RNA編輯技術(shù)大多未知。此外因篇，考慮到RNA甲基化修飾對(duì)mRNA代謝和翻譯有顯著影響泞辐，研究體外RNA甲基化靶向編輯技術(shù)對(duì)于增強(qiáng)mRNA藥物的效力具有重要意義。
總之竞滓，對(duì)RNA甲基化修飾的調(diào)控蛋白組分咐吼、測(cè)序技術(shù)、功能機(jī)制虽界、抑制劑和靶向編輯技術(shù)的深入研究將提供關(guān)于RNA甲基化修飾在生物發(fā)育和疾病發(fā)生中功能角色的廣闊視野汽烦，對(duì)于疾病診斷和治療也具有寶貴的視角徽缚。
參考文獻(xiàn)：
Yang W, Zhao Y, Yang Y. Dynamic RNA methylation modifications andtheir regulatory role in mammalian development and diseases. Sci China LifeSci. 2024 May 31. pii: 10.1007/s11427-023-2526-2. doi:10.1007/s11427-023-2526-2. PubMed PMID: 38833084.
