前言：
學(xué)術(shù)定義：原位雜交是基于DNA或RNA反義序列會與互補(bǔ)的RNA序列發(fā)生氫鍵作用。通過對 "反義 "探針進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，其結(jié)合的對應(yīng)的mRNA可以被觀察到。顧名思義仗处，原位雜交允許人們在適當(dāng)固定的細(xì)胞和組織內(nèi)分析mRNA的空間分布（即在原位），從而提供一個關(guān)于基因轉(zhuǎn)錄位置和這些轉(zhuǎn)錄物隨后如何處理的二維或三維視圖枣宫。
歷史發(fā)展：原位雜交最早于1969年引入，用于研究細(xì)胞水平的基因表達(dá)（Buongiorno-Nardelli & Amaldi, 1970吃环；John, Birnstiel, & Jones, 1969）也颤。后來，它被適應(yīng)于組織切片郁轻，最后翅娶，在更好的固定和溶解技術(shù)的幫助下，它被適應(yīng)于完整的組織和胚胎（Levsky & Singer, 2003回顧）好唯。
傳統(tǒng)的RNA FISH竭沫，直接在oligos 上標(biāo)記熒光染料，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則骑篙，與待檢測的RNA 特異結(jié)合蜕提，通過熒光顯微鏡檢測熒光信號，該方法一般需要20個oligos 以上靶端，以便檢測到較強(qiáng)較多的熒光信號點(diǎn)谎势。在我之前寫的miRNA 熒光原位雜交技術(shù)（FISH），就是采用的熒光標(biāo)記探針法杨名。除了其毋庸置疑的優(yōu)勢外脏榆，這些探針價格昂貴，并可能產(chǎn)生強(qiáng)烈的背景信號台谍，導(dǎo)致低含量miRNA的信噪比低须喂。
The first fluorescence in situ hybridization (FISH) approach was conducted in the early 1980s using an antisense RNA probe labeled with a fluorescent molecule covalently attached to its 3' end (Bauman, Wiegant, Borst, & van Duijn,1980).
However, this approach lacked sensitivity.
Better sensitivity was achieved by incorporating hapten-modified nucleotides (e.g., biotin-UTP) into the probes, which could then be detected using appropriate antibodies. Further sensitivity was achieved by incorporating secondary antibodies and additional enzymatic amplification steps.**
OVERVIEW AND PRINCIPLES
探針設(shè)計:
1.探針序列
對于標(biāo)記的mRNA，我習(xí)慣的做法是通過本地BLAST趁蕊，將mRNA比對至基因組坞生，選后選擇沒有相似區(qū)域的片段，隨機(jī)選一個片段（綜合考慮TM值介衔，堿基組成恨胚，長度等），取mRNA的互補(bǔ)序列（T轉(zhuǎn)為U）炎咖。為保證特異性赃泡，將設(shè)計好的探針再次BLAST比對寒波。
對于miRNA，沒有選擇余地升熊。同樣將其BLAST以了解其潛在的特異性俄烁。
2.探針長度
探針的長度對于最佳的成功也是至關(guān)重要的。最佳的探針長度在350到1000個堿基對（bp）之間级野。較長的探針會降低組織滲透性页屠，增加非特異性結(jié)合，并減少未結(jié)合探針的清除蓖柔。較短的探針會減少信號和增加非目標(biāo)結(jié)合辰企。
3.熒光選擇
當(dāng)檢測多個mRNA時，就要考慮多種熒光的搭配使用况鸣。必須對熟練掌握各種標(biāo)記的特性牢贸，熒光的光譜等，需要一定的知識儲備镐捧。
miRNA： miRNA_biotin + Alexa Fluor? 488 fluorescent streptavidin conjugates
mRNA, mRNA_Digoxin + Alexa Fluor 680-IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin
4.探針修飾
一個忽視的問題就是潜索，探針RNA如不加修飾，其穩(wěn)定性低懂酱。
Unmodified DNA and RNA probes have relatively poor binding affinity to target sequences [54], and therefore several modifications have been proposed to improve their properties竹习。
已開發(fā)的修飾的類型有：
Locked Nucleic Acid (LNA) ：鎖核酸修飾，應(yīng)用最廣列牺；
2′fluoro-modified RNA (2′F RNA)
morpholino：嗎啉代
Zip Nucleic Acids (ZNA)：
N,N-diethyl-4-(4-nitronaphthalen-1-ylazo)-phenylamine(ZEN)
2′O-Methyl (2′OMe) RNA：2′O-甲基（2′OMe）RNA修飾
可以參考生物公司關(guān)于修飾引物的介紹板塊整陌，如金斯瑞生物
其中，熒光修飾屬于“熒光選擇”部分需要考慮的問題昔园。
下圖總結(jié)了文獻(xiàn)中應(yīng)用各種探針的比例：
生物素標(biāo)記分為三類： Biotin蔓榄、Biotin TEG、Dual Biotin
biotin-teg中teg是三甘醇的縮寫默刚，在生物素中連接teg后可以延長生物素和核苷酸之間的距離甥郑，減少生物素和親和素結(jié)合時的位阻。因此荤西，使用biotin-teg的效果要好于biotin澜搅。
A dual biotin with two biotin molecules in sequence can increase binding strength with streptavidin. This helps to keep biotinylated DNA/primers on the beads during heating at higher temperatures, something that is a challenge for many customers. It has been seen that dual biotin prevents or effectively reduces leakage of biotinylated DNA from beads during heating (9).
信號放大:
1. 酪酰胺信號放大(Tyramide signal amplification)：
TSA原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結(jié)合位點(diǎn))，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物邪锌，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸勉躺、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉積觅丰，與隨后加入的Streptavidin—HRP/熒光基團(tuán)結(jié)合饵溅，經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大，可以結(jié)合大量的酶分子or熒光基團(tuán)妇萄，結(jié)果使其檢測信號得到幾何級放大蜕企。
簡單來說咬荷，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素轻掩。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化幸乒，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合唇牧。
該部分視頻學(xué)習(xí)資料：TSA在免疫組化和熒光原位雜交中的應(yīng)用
2. 鏈霉親和素偶聯(lián)物
鏈霉親和素蛋白是一類四聚體蛋白罕扎，大小為66kDa，每一分子SA 能夠與四分子生物素Biotin進(jìn)行高度特異性的結(jié)合丐重，且兩者之間的親和力較強(qiáng)腔召。應(yīng)用該原理，將染料Cy3 偶聯(lián)到SA 蛋白上扮惦，一分子SA 能偶聯(lián)上6 個Cy3宴咧；同時在探針上標(biāo)記生物素，將兩者在體外進(jìn)行親和連接径缅，大約每個SA 能與4 條Biotin-probe 結(jié)合，每個SA 上有6 個Cy3烙肺，也就是每一條探針上連接了6 個Cy3纳猪，因此該方法具有一定的放大信號的作用 。
Some of the simplest fluorescent detection schemes involving streptavidin entail
applying a biotinylated probe to the desired sample and then detecting the bound probe with a fluorescently labeled streptavidin. Fluorescent conjugates of streptavidin are commonly used to localize antigens in cells and tissues 4,5 and to detect biomolecules in immunoassays and DNA hybridization techniques.
推薦產(chǎn)品：
Alexa Fluor? 488 鏈霉親和素
Alexa Fluor? 488 鏈霉素親和素偶聯(lián)物的最大激發(fā)/發(fā)射波長分別為 ～ (495/519)
值得注意的是桃笙，天然生成的生物素可干擾生物素-鏈霉親和素檢測方案氏堤。對于涉及固定或通透化細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，可使用內(nèi)源性生物素封閉試劑盒最大限度減少這種干擾搏明。
染色成像:
參考文獻(xiàn)：
- Urbanek MO, Nawrocka AU, Krzyzosiak WJ. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 2015 Jun 10;16(6):13259-86. doi: 10.3390/ijms160613259. PMID: 26068454; PMCID: PMC4490494.
- Wilk, R., et al. (2017). "In Situ Hybridization: Fruit Fly Embryos and Tissues." Current Protocols Essential Laboratory Techniques 15(1).
3.LNA（Locked Nucleic Acid）堿基修飾技術(shù)
